microRNA在宫颈上皮内瘤变恶性转化过程中的作用及分子机制研究

发布时间：2018-04-08 15:15

本文选题：宫颈癌　切入点：宫颈上皮内瘤变癌变　出处：《重庆医科大学》2016年博士论文

【摘要】：宫颈癌是全球第二大常见的妇科肿瘤,在发展中国家,宫颈癌的发病率远远高于其他国家,占世界总量的80%。由正常组织向宫颈癌进展会历经轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生、原位癌、浸润癌的过程。但宫颈上皮内瘤变进展为癌也不是必然的,一般认为其癌变率约15-45%,绝大多数宫颈上皮内瘤变可自愈。目前正因缺乏上皮内病变恶性转化的确切靶标,导致临床常对宫颈上皮内瘤变有过度治疗。因此,筛选与鉴定可转化为宫颈癌的这一类上皮内病变的标志物是宫颈癌研究领域的重要科学问题之一。微小RNA(micro RNA以下简称miRNA)是非常重要的非编码调控分子,它介导调控多细胞生物基因表达转录后水平,且已被认为是的一种普遍调节方式。研究证实有一半的miRNA基因位于癌症相关基因区域,目前已证明许多miRNA与多种类型肿瘤的发生及发展相关,且在其中发挥关键作用。一些miRNA的功能丢失会引起肿瘤的发生,这类miRNA发挥着类似抑癌基因的功能,被称为“TSmiRs”。另一类在癌症中高表达的miRNA,能够促进肿瘤的发生发展,被称为“oncomir”。miRNA由于其自身的特点,在肿瘤诊断和治疗方面具有突出优势。其数量相对较少且分子小,检测灵敏度较传统的蛋白标记物更高,因此适于建立快速便捷的临床检测方法。在治疗方面,由于其分子小,体外合成方便,易于给药,安全性相对较高。因此,以mirna与肿瘤的发生和发展的相关性为切入点是一个全新的视野,作为肿瘤治疗靶点它显示出了巨大的潜能。我们首先通过mirna芯片分析了mirna在2例宫颈癌样本及2例正常宫颈样本中的表达情况,鉴定了一系列在宫颈癌中表达异常的mirna分子,其中多个是已知在宫颈癌发生发展中发挥促癌或抑癌作用的mirna。根据芯片结果,我们选择了在宫颈癌样本中显著上调或下调的10个mirna分子(mir-10b,mir-193b,mir-23b,mir-29a,mir-375,mir-320a,mir-21,mir-9,mir-15a,mir-16),通过taqman探针实时定量pcr的方法检测了这些mirna在40例宫颈癌及30例正常宫颈样本中的表达情况,结果显示mir-10b、mir-193b和mir-375在宫颈癌样本中的表达量显著低于正常宫颈上皮样本,mir-320a、mir-21、mir-15a和mir-16在宫颈癌样本中的表达量显著高于正常宫颈上皮样本。进一步为了明确这些mirna在宫颈上皮内瘤变进展为癌的过程中可能发挥的作用,我们分别在30例轻度不典型增生、32例中度不典型增生、37例重度不典型增生、35例原位癌、40例浸润宫颈癌样本中检测了mir-10b、mir-193b、mir-375、mir-320a、mir-21、mir-15a和mir-16的表达情况。结果显示mir-10b在宫颈上皮内瘤变进展为癌的过程中逐渐下降,且差异显著。mir-21在宫颈上皮内瘤变进展为癌的过程中逐渐上升,差异显著。说明两者可能在宫颈上皮病变为癌的过程中发挥非常重要的作用,而且mir-10b的低表达与患者是否发生癌变显著相关,提示其作为早期宫颈癌诊断标记物的可能性。进一步我们检测了mir-10b在宫颈癌发生中的作用。在宫颈癌细胞hela和siha中过表达mir-10b后,检测细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、细胞凋亡情况,发现mir-10b的过表达能够对宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭进行显著抑制,同时对宫颈癌细胞的凋亡有促进作用,提示其在宫颈癌发生过程中行使抑癌基因的功能。而在宫颈癌细胞hela和siha中抑制内源mir-10b表达后,同样检测细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、细胞凋亡情况,发现mir-10b的表达抑制能够对宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭显著促进,且对宫颈癌细胞的凋亡有抑制作用,说明mir-10b的显著下调可能是宫颈癌发生的重要原因之一。为了进一步探索mir-10b参与宫颈癌发生的具体机制,我们使用生物信息方法预测了mir-10b可能作用的靶基因,并构建了多个含靶基因3’utr区的报告基因载体,结果显示mir-10b的过表达能够显著抑制hoxa13’utr区的报告基因活性,且这种抑制作用依赖于hoxa13’utr区mir-10b的结合位点,进一步的westernblot实验显示mir-10b的过表达能够显著抑制hoxa1的蛋白表达,而mir-10b的抑制则能够促进hoxa1的蛋白表达,说明hoxa1是mir-10b作用的直接靶基因。hoxa1在宫颈癌细胞中的功能实验说明其能够促进宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭等。进一步的功能回复实验也说明mir-10b确实是通过直接靶向hoxa1参与调控宫颈癌发生发展的。在多个宫颈癌样品中检测hoxa1表达情况发现hoxa1在宫颈癌样本中显著上调,且表达量与miR-10ba表达水平呈显著负相关。这些证据表明在宫颈癌发生过程中miR-10b显著下调,正是这种下调导致了其靶基因HOXA1的异常高表达,进而促进了宫颈癌的发生。那么miR-10b在宫颈癌中显著下调的原因又是什么呢?已知DNA甲基化在基因沉默中具有重要作用,因此我们分析了miR-10b启动子区甲基化情况,发现在大量宫颈癌样本中miR-10b启动子Cp G岛均呈显著的高甲基化状态,且宫颈癌细胞Hela和SiHa经去甲基化酶处理后miR-10b表达水平显著上升,说明DNA甲基化可能是miR-10b在宫颈癌中表达下调的重要原因。因此使用去甲基化酶治疗宫颈癌可能激活多个抑癌miRNA的表达,从而达到抑制肿瘤生长的作用。综上所述,本研究工作鉴定了多个可能参与调控宫颈癌发生发展的miRNA分子,同时深入研究了miR-10b在宫颈癌发生中的作用及机制,丰富了宫颈癌发生的理论基础,同时为宫颈上皮内瘤变癌变的监控及干预提供新的思路和依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33

【相似文献】