CD47在非小细胞肺癌转移中的作用及相关机制研究

发布时间：2018-04-08 19:27

  本文选题：CD47　切入点：非小细胞肺癌　出处：《大连医科大学》2016年博士论文

【摘要】：背景和目的:肺癌在我国发病率极高,据报道近十几年肺癌分别占在我国男性和女性恶性肿瘤发病率的第一和第二位,并且发病年龄也出现了下降的趋势。其中非小细胞肺癌作为肺癌的一个大类发病率也逐年增高,近年来肺癌相关领域基础医学研究及临床诊断治疗方法逐渐进步,越来越多的肺癌患者得到了规范的治疗,使得肺癌的诊治率有了很大的提升,然而由于肺癌表现出较强的侵袭性,尤其是一旦肺癌发生转移,患者即将面临极高的死亡威胁。因此,总体来说,对肺癌的转移情况进行控制仍然是肺癌领域需要解决的重要关键问题。然而目前肿瘤转移相关分子机制仍不清楚。为了探索肿瘤转移的相关分子机制,近年来,CD47分子逐渐引起了大家的关注。其重要原因在于,研究发现肿瘤细胞可以表达 别吃我‖信号,从而使得巨噬细胞对肿瘤吞噬作用减低,出现肿瘤对免疫逃逸现象,这种现象与肿瘤转移密切相关。而肿瘤细胞高表达的CD47分子就是一种 别吃我‖信号分子。当肿瘤细胞表面CD47分子与巨噬细胞的表面SIRPα分子组合成CD47-SIRPα信号复合体时,导致巨噬细胞SIRPα分子的细胞内部结构中免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)发生磷酸化,因此可以传导抑制性信号通路,即 别吃我‖信号来减少巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性,这样便产生肿瘤细胞的免疫逃逸现象。而且CD47高水平表达与血液系统恶性肿瘤和部分实体肿瘤的分化程度、转移能力、生存率及预后密切相关。CD47与肿瘤相关性研究得到越来越多关注,然而CD47在肺癌表达及与转移的相关性等研究未见相关报道。另一方面,除了研究者关注的CD47-SIRPα信号复合体引起的肿瘤免疫逃逸现象,另有研究者提出cd47与肿瘤生长和转移的作用仍有其他机制参与其中,然而相关的机制研究甚少。因此,本研究亦将对cd47与转移的相关作用机制进行初步的探讨。我们通过组织标本和肺癌细胞株的cd47表达情况进行分别检测,并利用体内和体外实验分别对cd47与肺癌转移的相关性进行分析验证。最后对cd47与肺癌转移的相关机制进行初步探讨。本研究分以下三部分进行。研究方法:1.非小细胞肺癌组织cd47的表达及其临床意义选取20例非小细胞肺癌者切除的手术标本,利用westernblotting方法对癌及癌旁组织中的cd47表达水平进行检测。同时采用免疫组织化学检测方法对80例非小细胞肺癌患者的石蜡组织切片对cd47表达水平进行检测,通过免疫组织化学评分将80例患者按照cd47表达水平分为低表达cd47组和高表达cd47组,利用统计学分析的方法对不同cd47表达水平与病理分型、肿瘤分化程度及tnm分期等临床病理特征进行分析。2.cd47在nsclc侵袭转移中的作用本部分研究分别从体外实验和体内实验两方面进行阐述。体外实验部分:首先利用westernblot、real-timepcr和细胞免疫荧光对不同肺癌细胞株的cd47表达情况进行检测。为验证cd47表达水平与细胞转移能力的关系,我们构建了基于微流控芯片技术的转移模型。利用该模型我们可以对细胞在不同情况下的转移情况进行实时的动态观察。利用rna干扰技术和质粒转染技术分别下调或上调肺腺癌细胞株a549和肺鳞癌细胞株nci-h520的cd47表达,将进行不同处理的各组细胞株分别注入微流控芯片转移模型内观察72小时后细胞的转移情况,分析不同cd47表达水平表现出的肺癌细胞体外转移能力的差异和区别。体内实验部分:通过皮下注射构建原位肺癌模型、通过尾静脉注射构建肺癌移植模型,同时利用shrna稳定下调a549细胞的cd47表达,观察在两种动物模型中不同cd47表达的a549细胞的原位成瘤以及肿瘤转移情况,进一步验证cd47与肺癌发展转移的影响。3.cd47促进非小细胞肺癌转移机制的初步探讨为探讨cdc42作为cd47的下游分子参与非小细胞肺癌侵袭和转移我们进行以下研究,利用westernblot方法检测不同肺癌细胞株cd47和cdc42的表达情况;通过rna干扰技术和质粒转染技术分别下调或上调肺腺癌细胞株a549和肺鳞癌细胞株nci-h520的cd47表达,进一步观察cd47表达水平变化是否伴随cdc42表达改变。上调cd47表达的a549和nci-h520细胞株再利用rna干扰技术下调cdc42表达后观察不同处理情况的细胞株在微流控芯片转移平台内细胞转移能力的情况。最后对80例非小细胞肺癌患者的石蜡切片cd47表达与cdc42表达情况进行统计分析。结果:1.非小细胞肺癌组织cd47的表达及其临床意义利用westernblotting蛋白检测方法对20例非小细胞肺癌患者的手术切除组织标本的癌及癌旁组织中cd47表达水平进行检测,发现癌组织的cd47表达水平明显高于癌旁组织(p0.05)。同时采用免疫组织化学检测方法对80例非小细胞肺癌患者的石蜡切片对cd47表达水平进行检测,结果亦证实癌组织cd47表达明显高于癌旁组织,对不同患者的cd47表达水平进行分组,结果发现高表达cd47与tnm分期密切相关,高表达cd47的患者更易出现淋巴转移和远处转移;另外高表达cd47与临床分期亦相关,高表达cd47的患者临床分期越差。提过提示cd47表达水平与非小细胞肺癌的转移和侵袭相关,对cd47的表达检测将对临床转移和预后的判断具有重要意义。2.cd47在nsclc侵袭转移中的作用为了在体外观察验证细胞的转移能力,我们成功构建了基于微流控芯片技术的细胞转移模型。利用该模型我们可以实时对不同细胞的转移情况进行动态观察。为了更加全面验证的cd47在nsclc侵袭转移中的作用,我们分别选取了肺腺癌细胞株a549和肺鳞癌细胞株nci-h520分别进行检测分析。利用rna干扰技术成功将a549和nci-h520的cd47表达水平下调,进而将未处理和下调cd47表达的a549和nci-h520细胞分别注入微流控芯片转移模型内,观察72小时后细胞的转移情况,结果证实在下调cd47表达的a549和nci-h520细胞转移数量较对照组明显减少,差异具有统计学意义(p0.05)。为进一步验证,我们利用质粒转染a549和nci-h520细胞稳定上调cd47表达,结果发现在上调cd47表达后a549和nci-h520的细胞转移数量明显增高,差异具有统计学意义(p0.05)。体内实验进一步观察,稳定下调cd47表达的a549组6只裸鼠的皮下成瘤体积大小较a549组明显减小;在尾静脉注射转移模型小鼠中同样观察到稳定下调cd47表达的a549组形成的肝转移结节数量少于a549组。3.cd47促进非小细胞肺癌转移机制的初步探讨通过westernblot检测了不同肺癌细胞株cd47蛋白表达与cdc42蛋白表达情况,发现在高表达cd47的细胞株中cdc42也呈高表达,反之亦然。为验证cdc42作为cd47的下游分子参与了肺癌细胞的侵袭和转移,我们对a549和nci-h520分别下调或上调cd47表达,利用westernblot检测了cdc42的蛋白表达情况,结果表明cd47表达水平的变化伴随了cdc42表达水平的改变。对80例肺癌患者对组织切片进行免疫组织化学染色观察,发现在高表达cd47的患者中80.4%也存在cdc42高表达;在低表达cd47的患者中85.3%也存在cdc42低表达。表明cd47表达调节了cdc42的表达情况。为进一步验证cd47通过cdc42调节细胞的转移和侵袭,我们利用质粒转染a549和nci-h520上调cd47的表达,再利用rna干扰技术下调cdc42表达,在微流控芯片转移平台内观察下调cdc42表达后细胞的侵袭转移数量较未下调cdc42表达的对照组明显减少,差异有统计学意义(p0.05)。结论:1.通过westernblot和免疫组织化学染色检测到非小细胞肺癌组织标本的cd47表达癌组织明显高于癌旁组织;cd47表达与患者转移情况、临床分期相关,高表达cd47的患者临床分期越差、更易出现淋巴转移和远处转移。因此提示cd47分子可以在非小细胞肺癌中判断侵袭和转移的一个指标。2.成功构建了可以模拟细胞侵袭转移过程的微流控芯片转移模型。在该芯片模型内可以实现细胞的三维培养并对细胞的侵袭转移数量进行实时的动态观察,通过比较转移细胞数量的差别来直观验证细胞的转移能力。采用肺腺癌细胞株a549和肺鳞癌细胞株nci-h520作为研究对象,利用rna干扰技术和质粒表达下调和上调两种细胞株的cd47表达,观察两种细胞株在微流控芯片转移模型内处理前后细胞转移数量的差异,证实cd47表达与细胞的转移侵袭能力中发挥重要作用。进一步在体内成瘤以及转移模型中亦证实下调CD47表达,A549细胞体内成瘤和转移能力均降低。说明CD47分子在判定非小细胞肺癌的侵袭和转移现象中起到重要的作用。3.CD47在肺癌细胞株中表达水平的变化伴随Cdc42分子的表达水平改变。在肺癌患者组织标本中我们亦证实Cdc42表达水平与CD47表达相关。利用微流控芯片的转移模型观察到下调Cdc42表达可以干预CD47高表达所引起到细胞转移性增加。这些结果初步阐明了Cdc42作为CD47的下游分子参与了肿瘤细胞的侵袭转移过程,为肺癌的转移机制和临床诊治提供了有益的帮助。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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本文编号：1723042