紫杉醇与阿霉素联合载药纳米脂质体的制备及其对肺癌的协同治疗作用研究

发布时间：2018-04-10 19:48

本文选题：纳米脂质体 + 紫杉醇　；参考：《山东大学》2015年博士论文

【摘要】：紫杉醇(Paclitaxel, PTX)和阿霉素(doxorubicin, DOX)是最具代表性的两种化疗药物,因其特有的药物作用机制,它们被广泛应用于多种实体瘤的联合化疗中。然而,应用游离体形式联合化疗仍存在肿瘤抑制率低、毒副反应重、易诱发多药耐药的弊端。同时,PTX与DOX都具有难溶于水的性质,从而导致药物配置过程繁琐、药物输注过程复杂。纳米脂质体载药系统(nanostructured lipid carrier, NLC)制备技术成熟、药物性能稳定,现有的抗肿瘤药物纳米脂质体展现出较好的药物稳定性、较好的药物控释能力、较轻的药物毒副反应等优点,因此,纳米脂质体是制备二者共载系统的理想载体。本研究通过熔融乳化技术,首次成功制备PTX-DOX共载纳米脂质体；在体外检测了该脂质体对人非小细胞肺癌细胞株NCL-H460的抑瘤能力；并通过构建的NCL-H460荷瘤裸鼠模型,评价了PTX、DOX共载纳米脂质体的体内抗癌效果。第一部分PTX-DOX共载纳米脂质体的制备研究目的：纳米脂质体的组成和结构使其具有广泛的药物包容性,从小分子化学药物到生物大分子都可以通过脂质体来控制释放。药物经脂质体包封后,其动力学发生了很大的变化,药物在血液循环中的半衰期延长,药物的毒副反应降低,药物溶解性得到了提高。纳米脂质体的结构与生物膜的结构相同,可以通过多种途径进入血液循环,可以增加药物制剂的靶向性,能够减少治疗剂量。本部分研究旨在建立一种两药联合共载纳米脂质体,共同载药PTX和DOX。这种药物共载体系,最大化的发挥联合化疗的优点,最小化减轻联合化疗的缺点,解决单独用药易出现的多药耐药性问题,特异性靶向杀伤肿瘤细胞,减轻对正常细胞和组织的损伤。研究方法：本研究采用熔融乳化技术制备PTX-DOX共载纳米脂质体。纳米粒径分析仪分析其粒径、粒径分布、表面电荷数及多分散指数(polydispersity index, PDI),采用紫外分光光度法于480 nm处分析微球中DOX的含量,采用高效液相色谱法分析微球中PTX含量；采用透析法测定PTX-DOX共载纳米脂质体的体外释药特征。研究结果：本研究中制备的纳米脂质体经过测定,空白NLC及载药NLC的粒径均介于125-130 nm之间,PDI值为0.18,表明所制备的脂质体具有良好的分散性。Zata电位+27 mV说明PTX-DOX-NLC稳定性较高,NLC易靶向转运至癌细胞。PTX-DOX-NLC的载药量与载药率相比于PTX-NLC、DOX-NLC均有轻微下降,但下降幅度不大。结合粒径及Zata电位的实验结果,说明即使载药量与载药率轻微下降,但该纳米脂质体的稳定性未受影响。PTX-DOX-NLC体外释药过程符合Higuchi线性方程,药物释放呈现持续而缓慢的释放,PTX以及DOX在24h内释放率可达70%以上。对比PTX-DOX-NLC、PTX-NLC和DOX-NLC三种纳米脂质体药物体外释放曲线,发现三者药物释放速率基本相当,PTX-DOX-NLC中PTX和DOX都于48 h内缓慢释放,表明PTX-DOX-NLC具有缓释PTX和DOX的能力。研究结论：本研究通过熔融乳化技术成功制备共同载有PTX-DOX的纳米脂质体,空白NLC及载药NLC的粒径均介于125-130nm之间,说明包封PTX与DOX并未影响纳米脂质体的粒径。PTX-DOX-NLC的载药量与载药率相比于PTX-NLC、DOX-NLC有轻微下降,但该纳米脂质体的稳定性未受影响。PTX-DOX-NLC体外释药过程符合Higuchi线性方程,PTX-DOX-NLC具有缓释PTX和DOX的能力。第二部分PTX-DOX-NLC的体外抗肿瘤活性研究研究目的：药物对人癌细胞的破坏作用即细胞毒性试验,细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的细胞杀伤事件,它不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行,最常用的方法是MTT比色法。本部分研究利用MTT比色法检测细胞增殖抑制率,经统计学分析,实际评价PTX-DOX-NLC对人非小细胞肺癌细胞株NCL-H460的抗肿瘤活性。研究方法：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法,其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法被常规应用于细胞毒性试验。它的特点是灵敏度高、经济。本研究中应用MTT法检测细胞增殖抑制率,采用统计软件SPSS 17.0处理数据,计算IC50,对比不同浓度药物下细胞增殖抑制率,探索药物作用模式、最佳剂量和细胞毒性。同样方法测定PTX/DOX不同比例联合载药的PTX-DOX-NLC抑制肿瘤细胞增殖活性,从而筛选最佳的联合载药比例。研究结果：用载药NLC或游离药物处理48h的NCL-H460细胞,其存活率呈剂量依赖性降低,且以脂质体形式联合给药PTX-DOX对人非小细胞肺癌细胞的抑制效果最佳。与其他比例相比,PTX-DOX-NLC中的PTX/DOX值为1/1时,IC50最低,因此可确定为最佳比例。脂质体给药的细胞毒性要大于游离形式,约为其2-3倍,而PTX-DOX-NLC的细胞毒性更强,高于载单一药物NLC(3倍)及游离药物(9倍)(P0.05)。研究结论：采用MTT法测定细胞存活率,对比PTX-DOX-NLC、PTX-NLC、 DOX-NLC.游离PTX、游离DOX不同浓度处理NCL-H460,结果表明用载药NLC或游离药物处理48h的NCL-H460细胞,其存活率呈剂量依赖性降低,且以脂质体形式联合给药PTX-DOX对人非小细胞肺癌细胞的抑制效果最佳。本研究以抑制细胞增殖活性IC50为参数,采用不同的联合载药比例,从而筛选出了最佳的联合载药比例：PTX-DOX-NLC中的PTX/DOX值为1/1时,IC50最低,因此确定1/1为最佳比例。PTX-DOX-NLC的细胞毒性高于载单一药物NLC及游离药物(P0.05),说明PTX-DOX-NLC抗肿瘤作用靶向性最明确。第三部分PTX-DOX-NLC对NCL-H460荷瘤裸鼠的抗肿瘤研究研究目的：SPF级BALB/c (5-6周龄,体重约为18-22 g)裸鼠被广泛应用于肿瘤学、免疫学、毒理学等基础医学和临床医学的研究。通过建立人非小细胞肺癌株NCL-H460荷瘤裸鼠模型,比较联合载药纳米脂质体与游离药物的体内抑瘤效果。研究方法：皮下注射法建立NCL-H460荷瘤裸鼠模型,动态观察裸鼠肿瘤生长及食欲活动变化等情况。绘制连续给药21天肿瘤生长曲线；对比不同给药形式肿瘤生长抑制率。实验数据采用mean±SD表示,采用SPSS 17.0统计分析软件对所得样本进行统计分析。首先进行正态分布检验,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P0.05差异具有统计学意义。研究结果：NLC制剂组的抑瘤效果显著优于游离药物组。PTX-DOX-NLC具有最高抑瘤率为84%,其次DOX-NLC抑瘤率为65%,PTX-NLC抑瘤率为64%,游离DOX和PTX抑瘤率为26%。PTX-DOX-NLC、PTX-NLC、DOX-NLC均可显著抑制肿瘤的生长(P0.05),且PTX-DOX-NLC效果最好。给予NLC制剂处理的三组小鼠,体重均未有明显的变化,但游离药物给药组及阴性对照组小鼠均出现了体重的明显下降,并伴随进食量减少、活动量减少。研究结论：对NCL-H460荷瘤裸鼠模型分组注射PTX-DOX-NLC,PTX-NLC, DOX-NLC,游离PTX,游离DOX和0.9%生理盐水(NS),得到肿瘤生长曲线。实验结果表明PTX-DOX-NLC,PTX-NLC和DOX-NLC制剂均可显著抑制肿瘤的生长(P0.05),且PTX-DOX-NLC效果最好。NLC制剂组的抑瘤效果显著优于游离药物组。对不同给药组进行肿瘤抑制率的分析,结果为PTX-DOX-NLC具有最高抑瘤率为84%,其次为DOX-NLC 65%, PTX-NLC 64%,游离DOX和PTX抑瘤率为26%。因PTX和DOX两种药物具有协同效应,PTX-DOX-NLC具有最好的抑瘤效果,且毒副反应最轻。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

【共引文献】