人E3泛素连接酶MDM2与核糖体蛋白RPL11复合物的结构与功能研究

发布时间：2018-04-16 02:24

本文选题：X射线晶体学 + 肿瘤　；参考：《中国农业大学》2015年博士论文

【摘要】：抑癌基因的失活和原癌基因的异常激活会导致恶性肿瘤的发生,而p53是研究最为广泛的抑癌基因,它在抑制肿瘤方面发挥着重要作用。p53作为转录因子能够激活下游众多具有不同生物学功能的靶基因的转录,因而具有广泛的生物学功能,包括促进细胞周期阻滞、DNA修复和细胞凋亡等。在正常情况下,p53处于被抑制状态,这是由于E3泛素连接酶小鼠双微体2(Murine double minute2, MDM2)能够抑制其转录活性并介导其发生泛素化降解。而同时MDM2又是p53蛋白调控的靶基因,因此两者可以形成MDM2-p53负反馈环路。细胞在应答不同的胁迫刺激时,会有不同的信号因子调控这个负反馈环路。DNA损伤会激活ATM (Ataxia telangiectasia mutated)/ATR (ATM Rad3related kinase)等激酶从而介导DDR (DNA damage response)信号通路；病毒侵染或癌基因过量表达会诱导肿瘤抑制因子ARF (Alternating reading frame)表达,进而介导ARF-MDM2-p53信号通路；核糖体合成受阻引起“核糖体胁迫”能够通过核糖体蛋白(Ribosomal proteins, RPs)介导RPs-MDM2-p53信号通路,细胞主要通过以上三条信号通路激活p53。研究发现在RPs-MDM2-P53信号通路中,RPL1l是激活p53最为重要的核糖体蛋白。但是,RPL1l如何抑制MDM2的E3泛素连接酶活性以实现激活p53的分子机制尚不清楚。本论文经过筛选大量不同的蛋白片段,通过原核表达并纯化获得人源MDM2290-437-RPL111-178蛋白复合物,采用坐滴蒸气扩散法获得MDM2-RPL11复合物晶体,通过分子置换法解析了其三维空间结构。在MDM2-RPL11复合物结构中,MDM2的结构由一个31α螺旋和2对反向平行的p折叠以及连接它们的loop组成；RPL11的结构由6个α螺旋和7个β折叠以及连接它们的loop组成。RPL11的整体结构类似于弯曲的“手”,MDM2紧紧地结合在RPL11形成的凹槽结构内。MDM2和RPL11之间存在极广泛的接触面,并且形成多种相互作用力,包括静电作用、氢键、疏水作用和π-π堆积作用力。结构分析显示在MDM2-RPL11复合物中存在两个锌指结构,一个是存在于MDM2蛋白分子内的C4型锌指结构,另一个是分子间锌指结构。实验证明这两个锌指结构对于MDM2和RPL1l的结合都发挥关键作用。此外,结构分析和定点突变实验证明MDM2的酸性结构域对于MDM2-RPL11互作也很重要,同时体外的pull-down实验和体内的免疫共沉淀实验确定了MDM2-RPL11发生结合的关键位点,并且证实这些关键位点的氨基酸残基发生突变会破坏MDM2-RPL11的结合,最终致使p53无法被激活。基于结构分析的定点突变实验阐明了癌症患者体内RPL1l和MDM2中关键性结合位点的突变是导致肿瘤发生的原因所在。另外,由于RPL11是核糖体60S大亚基的重要组成成分,其在核糖体内与28SrRNA结合,将MDM2-RPL11和60S RPLll-28SrRNA复合物进行结构比对,结果显示MDM2模拟28S rRNA与RPL11相结合,并且凝胶阻滞实验和微量热涌动实验也表明MDM2能够与核酸竞争性地结合RPL11。在MDM2-RPL11形成复合物后,RPL11和MDM2均发生构象变化,使得两者结合更加紧密。MDMX (Murine double minute X)是MDM2的同源蛋白,两者具有高度保守的功能结构域,序列比对、结构分析和定点突变实验均表明MDM2中C4锌指结构域决定了RPL11选择性地结合MDM2并不结合MDMX。本论文的实验结果在一定程度上揭示了RPL11如何抑制MDM2的E3泛素连接酶活性进而激活p53的分子机制,从而为新型抗癌药物分子的设计提供结构依据。
[Abstract]:p53 , as a transcription factor , can activate transcription of many target genes with different biological functions .
The expression of tumor suppressor factor ARF ( ARF ) can be induced by viral infection or overexpression of oncogene .
It is found that RPL11 is the most important ribosomal protein in the activation of p53 . However , it is not clear how to inhibit the activity of E3 ubiquitin ligase to activate p53 .

In this paper , a large number of different protein fragments were screened , and the human MDM2290 - 437 - RPL111 - 178 protein complexes were obtained by prokaryotic expression and purification .
The structure of RPL11 is similar to that of RPL11 . The structure analysis shows that there are two zinc finger structures in RPL11 .

The experimental results of this paper show some extent how RPL11 can inhibit the activity of E3 ubiquitin ligase and activate the molecular mechanism of p53 , thus providing structural basis for the design of novel anti - cancer drug molecules .

【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3

【共引文献】