下调GPI对人结肠癌细胞凋亡、迁移的影响及相关机制研究

发布时间：2018-04-16 06:48

本文选题：磷酸葡萄糖异构酶(GPI) + 结肠癌细胞　；参考：《重庆医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：结肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤,作为第三大常见肿瘤,每年大概有超过一百万的患者被确诊为结肠癌。近年来,结肠癌的发病率和死亡率逐年递增,在我国表现尤为突出,达到甚至超过了西方国家水平;我国结肠癌的高发年龄为50-60岁,比西方国家早10岁[1]。即便近年来结肠癌的诊断和治疗取得了飞跃性的进展,但是其具体的病理机制仍然不太清楚。所以,深入研究结肠癌发病的分子机制和细胞机制,为结肠癌的早期诊断和靶向治疗提供理论依据和线索很有必要。磷酸葡萄糖异构酶(Glucose phosphate isomerase,GPI)广泛分布于人体各组织中,是细胞内糖酵解和糖异生过程中的关键酶,可促进6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate)和6-磷酸果糖(fructose-6-phosphate)相互转换。当GPI被分泌到胞外,作为自分泌活动因子(autocrine motility factors,AMF),以自分泌的形式与细胞自身或邻近细胞表面受体(autocrine motility factor receptor,AMFR)相结合影响细胞的增殖、凋亡、迁移等。研究表明,GPI/AMF在乳腺癌,肾癌,肺癌,子宫内膜瘤,骨肉瘤,胃肠道肿瘤等多种肿瘤中呈高表达状态[2-6],在结肠癌患者的尿液和血清中,GPI/AMF的水平较正常人升高[7]。大量文献报道,GPI不仅与肿瘤的发生和分级密切相关,还能影响肿瘤细胞的凋亡、迁移及浸润等[6,8-10]。水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)家族成员与肿瘤的发生发展息息相关,Chulso Moon等人报道AQP1、AQP3、AQP5在HCT-116、HT-20、SW480等7种结肠癌细胞中表达[11]。其中,AQP3在呼吸系统(气道、肺等)、消化系统(胃、结肠)、泌尿系统、感觉器官(眼、泪腺)中均有表达。AQP3的激活可以使某些肿瘤细胞迁移能力变强(如胰腺癌细胞株MPC-83)。在结肠癌中,癌组织AQP3的表达也明显高于癌旁组织。AQP3在淋巴结转移、组织的分化程度和远处转移中发挥了重要作用。众所周知,PI3K/AKT信号通路普遍存在于各种细胞中,与肿瘤的发生发展密切相关。在结肠癌中,PI3K/AKT信号通路的反常激活[12],能够调控下游基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)等基因,从而影响肿瘤细胞的浸润、迁移等过程[13-14]。研究还发现PI3K/AKT信号通路在h EGF诱导AQP3表达中也扮演了重要角色[15]。因此,我们设想下调GPI/AMF是否能影响结肠癌细胞HCT-116的凋亡和迁移?人结肠癌HCT-116细胞的迁移是否与AQP3相关?PI3K/AKT信号通路在此过程中是否起到至关重要的作用?目的本文以人结肠癌细胞株为研究对象,筛选出GPI高表达细胞株。尝试探索GPI对结肠癌细胞凋亡,迁移,浸润及AQP3表达水平的影响,并探讨其对迁移及浸润影响的可能机制,为靶向GPI治疗结肠癌提供研究线索和实验依据。方法运用RT-PCR和Western-blot分别检测常规培养的人结肠癌细胞株HT-29、HCT-116、SW480及caco2中GPI的m RNA和蛋白表达情况,筛选GPI高表达的结肠癌细胞株;CCK-8法确定筛选GPI稳定转染HCT-116细胞株的嘌磷霉素浓度;慢病毒质粒感染构建干扰GPI的HCT-116细胞,嘌磷霉素筛选稳定感染细胞株后,于荧光显微镜下观察转染效率;Western-blot和RT-PCR法检测感染前后GPI表达水平;采用FCM(Flow cytometry)法检测干扰GPI前后HCT-116细胞株的周期和凋亡情况;划痕实验检测干扰GPI对HCT-116细胞迁移的影响;Transwell检测干扰GPI对HCT-116细胞迁移及浸润的影响;Western-blot检测细胞周期调控蛋白Cyclin D1,促凋亡蛋白Bax,抗凋亡蛋白Bcl-2,抑癌蛋白p53和激活型caspase3,迁移相关蛋白基质金属酶MMP3、MMP9,水通道蛋白AQP3,PI3K/AKT信号通路蛋白PI3K、AKT、p-AKT的表达。通过分别设立PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002,干扰GPI单独或联合应用来探究GPI/AMF,PI3K/AKT信号通路与MMP3、MMP9、AQP3之间的上下游关系。结果1.RT-PCR和Western-blot结果显示:HT-29、HCT-116、SW480、caco2四株结肠癌细胞株中,GPI的m RNA和蛋白表达量最高的是HCT-116细胞,故后续实验选用HCT-116细胞为实验对象。2.CCK-8结果显示:0.8μg/m L的嘌磷霉素,对HCT-116细胞的抑制率接近95%。故选用0.8μg/m L的嘌磷霉素进行干扰GPI稳定感染株的筛选。3.成功构建干扰GPI的慢病毒质粒,HCT-116细胞感染重组质粒后,嘌磷霉素筛选,于荧光显微镜下观察,发现si GPI组的细胞几乎全被慢病毒感染;si GPI组GPI基因的m RNA及蛋白表达水平下调。RT-PCR结果显示,与parental组比较,si GPI组细胞的GPI m RNA的抑制率为30.0%,有显著性差异(P0.05),mock组与parental组相较无明显差异(P0.05);Western-blot结果显示:与parental组比较,si GPI组细胞GPI蛋白抑制率为55.0%,有显著性差异(P0.05),mock组与parenta组相较无明显差异(P0.05)。4.FCM检测细胞周期:si GPI组细胞G0/G1期所占比例(65.81±2.16)%明显高于与parental组(58.07±1.69)%(P0.05),mock组(59.03±2.76)%与parental组比较无显著性差异(P0.05);与parental组相较,si GPI组的G2/M期和S期的细胞占比数量明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。5.FCM检测细胞凋亡:si GPI组细胞凋亡率(24.74±4.75)%明显高于parental组(8.48±1.97)%(P0.05),mock组(9.67±1.71)%与parental比较无显著性差异(P0.05)。6.Western-blot检测周期蛋白及凋亡蛋白:与parental组比较,si GPI组细胞周期蛋白Cyclin D1和凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达下调,抑癌蛋白p53、促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase3的表达上调,且均有显著性差异(P0.05),mock组与parental组比较无显著性差异。7.划痕实验结果显示:与parental组比较,si GPI组细胞迁移速度减慢,mock组与parental组比较,细胞迁移速度无明显差别;干扰GPI、LY294002单独或联合应用均会使得细胞迁移速度变慢。特别是当干扰GPI和LY294002联合应用时,细胞迁移速度变得更为缓慢。8.Transwell结果显示:与parental组比较,si GPI组的穿膜细胞数明显减少,mock组与parental组相较,穿膜的细胞数量无明显变化;干扰GPI、LY294002单独或联合应用均会使得穿膜细胞数量减少。特别是当干扰GPI和LY29002联合应用时,穿膜细胞的数量减少的更为明显。9.Western-blot检测迁移相关蛋白及PI3K/AKT信号通路相关蛋白:与parental组比较,si GPI组细胞迁移相关蛋白MMP3、MMP9、水通道蛋白AQP3、PI3K/AKT信号通路蛋白PI3K、p-AKT的蛋白水平均明显下调(P0.05),AKT蛋白表达量无明显变化。10.Western-blot检测LY294002和GPI si RNA单独或联合诱导结肠癌细胞后相关蛋白表达情况:LY294002可以抑制PI3K/AKT信号通路的激活,同时下调MMP3、MMP9、AQP3蛋白的表达,但对GPI蛋白的表达没有明显影响。与LY294002单独处理结肠癌细胞比较,干扰GPI和LY294002联合处理细胞时,GPI、MMP3、MMP9、AQP3、PI3K、p-AKT蛋白水平明显降低(P0.05),AKT蛋白量无明显变化;与si GPI比较,干扰GPI和LY294002联合应用时,MMP3、MMP9、AQP3、PI3K、p-AKT蛋白水平均显著下降(P0.05),GPI、AKT蛋白表达量无明显变化。结论1.下调结肠癌细胞GPI后,细胞周期被阻滞于G0/G1期,并能诱导结肠癌细胞凋亡。其可能的机制是通过激活p53信号通路,抑制周期蛋白Cyclin D1的表达,同时扰乱Bcl-2/Bax比例,激活caspase3,共同促进HCT-116细胞凋亡。2.干扰GPI对人结肠癌细胞的迁移抑制作用可能是通过抑制GPI/AMF下游PI3K/AKT信号通路的激活,减少MMP3、MMP9、AQP3的表达来实现。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.35

【参考文献】