参芪扶正注射液通过STAT1协同干扰素治疗肝细胞癌的机制研究

发布时间：2018-04-16 09:38

本文选题：参芪扶正注射液 + 干扰素-α　；参考：《北京中医药大学》2017年硕士论文

【摘要】：原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是目前世界上最常见的,而且是恶性程度最高的恶性肿瘤之一,位居全球恶性肿瘤死因的第3位。由于较高的乙型肝炎感染率,我国是肝癌的高发国家,每年至少30万人死于肝癌,占全世界肝癌死亡人数的半数以上,是我国第二位癌症杀手。近年世界各地肝癌的发病率有上升的趋势。经过几十年努力,肝癌的临床与基础研究均取得了一定进展,但肝癌的总体预后并没有得到显著的改善,其5年生存率仅为3%-5%。手术仍是目前治疗肝癌最有效的方法,但肝癌手术后总复发率高达50%-100%,术后高转移复发率已成为进一步提高远期疗效的瓶颈,也是攻克肝癌的关键。因此,寻找临床切实可用的措施来减少肝癌术后复发转移尤为必要。IFN-α具有抗病毒感染、调节免疫功能、抑制细胞增殖、抗肿瘤新生血管形成等生物学作用,现已被广泛应用到肝癌等恶性肿瘤的治疗研究中。研究显示大剂量长期使用IFN-α可抑制裸鼠体内肝癌细胞的增殖及侵袭性。目前,IFN-α已成为临床预防肝癌术后复发的常规治疗方案之一。但是由于部分肝癌患者不能耐受长期大量使用IFN-α所带来的不适及副作用,限制了其在临床上的广泛应用,而且临床随机分组研究发现肝癌切除术后给予IFN-α治疗虽可延长患者的生存,推迟复发,但与对照组相比复发率并未降低,部分患者在停药一段时间后再次使用IFN-α疗效不佳。究其原因是长期使用IFN-α后肝癌对其产生耐药性。因此明确肝癌对IFN-α产生耐药性的原因,并据此采取有效的针对性措施,将有助于提高IFN-α的疗效,降低IFN-α的使用剂量及副作用,降低术后复发转移率,对于提高肝癌患者的预后具有十分重要的意义。我们研究发现益气扶正法的代表药物参芪扶正注射液可有效抑制肝癌的生长转移,并证实其可显著增强肝癌组织内STAT1表达,鉴于STAT1的高表达是降低IFN-a耐药性的关键,我们推测参芪扶正注射液可有效减少肝癌对IFN-a的耐药性。本研究通过建立具有肺转移潜能的人肝癌细胞株MHCC97L及其裸鼠肝癌模型,采用MTT、Transwell、ELISA、荧光定量PCR、Western Blot、免疫组化、寡核苷酸芯片及RNA干扰等技术,系统研究参芪扶正注射液协同IFN-a抑制肝癌生长转移及复发的作用,揭示参芪扶正注射液对JAK/STAT信号通路的影响,阐明参芪扶正注射液降低IFN-a耐药性的机制,为临床联合使用参芪扶正注射液和IFN-a防治肝癌术后复发转移提供理论依据。研究目的:1.观察参芪扶正注射液协同IFN-α抑制肝癌细胞MHCC97L增殖及侵袭的作用;2.构建STAT1基因"沉默"的肝癌细胞MHCC97L瘤株,并验证其STAT1基因表达抑制效果;3.在STAT1基因"沉默"的MHCC97L瘤株上检验其侵袭性及增殖能力,从而验证参芪扶正注射液协同IFN-α抑制肝癌细胞的机制。研究方法:1.观察参芪扶正注射液协同IFN-α抑制肝癌细胞MHCC97L增殖及侵袭的作用;1.1通过MTT实验研究参芪扶正注射液协同IFN-α对MHCC97L瘤株增殖作用的影响培养复旦大学肝癌研究所建立的具有肺转移潜能的人肝癌细胞株MHCC97L,通过细胞增殖实验(MTT)检测小剂量参芪扶正注射液及IFN-α单独或联合使用对MHCC97L细胞增殖的影响;1.2通过体外侵袭实验实验研究参芪扶正注射液协同IFN-α对MHCC97L瘤株侵袭性的影响通过体外侵袭实验(Transwell)检测参芪扶正注射液及IFN-α单独或联合使用对MHCC97L细胞侵袭性的影响Western Blot/RT-PCR实验检测参芪扶正注射液及IFN-α单独或联合使用对MHCC97L细胞STAT1表达的影响。2.构建STAT1基因"沉默"的肝癌细胞MHCC97L瘤株,并验证其STAT1基因表达抑制效果:收集前一实验获取的肿瘤细胞(大剂量IFN-α单独治疗组及参芪扶正注射液和IFN-α联合治疗组肝癌细胞);用SuperArrαy公司JAK/STAT信号通路寡核苷酸芯片筛选上述肝癌组织差异表达基因(该芯片包含所有已知的JAK/STAT家族成员、激活JAK/STAT信号通路的受体、STAT蛋白相关的核辅助因子及共同活化因子、STAT诱导蛋白及负反馈调节蛋白);Western Blot及荧光定量PCR技术从蛋白质及mRNA水平验证寡核苷酸芯片筛选出的差异表达基因。3.在STAT1基因"沉默"的MHCC97L瘤株上检验其侵袭性及增殖能力:3.1通过MTT实验研究参芪扶正注射液协同IFN-α对MHCC97L瘤株增殖作用的影响:培养STAT1基因"沉默"的MHCC97L瘤株,通过细胞增殖实验(MTT)检测小剂量参芪扶正注射液及IFN-α单独或联合使用对STAT1基因"沉默"的MHCC97L细胞增殖的影响;3.2通过体外侵袭实验实验研究参芪扶正注射液协同IFN-α对STAT1基因"沉默"的MHCC97L瘤株侵袭性的影响;通过体外侵袭实验(Transwell)检测参芪扶正注射液及IFN-α单独或联合使用对STAT1基因"沉默"的MHCC97L细胞侵袭性的影响。研究结果:MTT实验发现:与单独使用IFN-α比较,参芪扶正注射液联合IFN-α可显著增强对人肝癌MHCC97-L的抑制作用;Transwell实验发现:参芪扶正注射液联合小剂量 IFN-α 组 MHCC97L 细胞迁移个数(17.67±1.53)与小剂量 IFN-α 组(27.67±3.06)细胞迁移个数相比较显著降低;RT-PCR实验结果显示:参芪扶正注射液组的MHCC97L细胞STAT1 mRNA的表达量明显高于NaCl阴性对照组,说明0.5g/L的参芪扶正注射液可以有效上调肝癌细胞MHCC97L的STAT1 mRNA表达。而IFN-α组与阴性对照组相比较无显著性差异;Western blot实验结果显示:参芪扶正注射液组的MHCC97L细胞STAT1蛋白质的表达量明显高于NaCl阴性对照组,说明0.5g/L的参芪扶正注射液可以有效上调肝癌细胞MHCC97L的STAT1蛋白质表达。而IFN-α组与阴性对照组相比较无显著性差异;通过RNAi有效实现了 MHCC97L的STAT1基因过表达,并成功构建了 STAT1基因RNAi病毒载体质粒,经慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L后,STAT1基因在mRNA水平及蛋白质水平出现了明显抑制;参芪扶正注射液联合IFN-α对STAT1基因"沉默"后的MHCC97L细胞株的抑制作用与阴性对照组(P0.05)和IFN-α组(P0.05)相比较无显著性差异;通过Transwell实验,结果显示STAT1基因"沉默"后,参芪扶正注射液联合小剂量IFN-α组中MHCC97L细胞的迁移个数(28.00±2.00)与小剂量IFN-α组(28.33±4.04)相比无显著性差异。结论:参芪扶正注射液在治疗肝细胞癌的过程中,可以通过提高STAT1的基因表达,达到针对IFN-α的增效作用。
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【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【参考文献】