iASPP在胃癌中的作用及其与KLF4的关系

发布时间：2018-04-16 16:27

  本文选题：iASPP + 胃癌　； 参考：《重庆医科大学》2015年博士论文

【摘要】：背景和目的胃癌的发生发展与多种因素相关,如癌基因的激活、抑癌基因的突变或功能抑制等。P53与人类肿瘤关系密切,其野生型可维持细胞正常功能的运行,若其发生突变则可导致肿瘤的发生。但约有三分之二的胃癌发生发展过程中并未发生P53的突变,肿瘤细胞是怎样逃过野生型P53的监视发展而来,其中机制尚不清楚。iASPP为ASPP家族中的一员,可抑制野生型P53的功能,其在多种肿瘤中被认为是癌基因。iASPP在胃癌中的研究较少,曾有报道称其表达与HP感染有关,但其在胃癌中的作用及其自身调控机制尚无文献报道。KLF4在胃癌中是一个抑癌基因,胃癌的发生发展与KLF4的异常低表达密切相关。KLF4与P53之间存在相互作用,而iASPP是P53抑制蛋白,三者之间存在功能上的联系。且基因软件分析在iASPP启动子区存在KLF4的结合序列,推测iASPP与KLF4之间也存在着调控关系。故本研究的主要目的为：明确iASPP在胃癌中的表达情况；探索iASPP在胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭及转移中的作用；探讨iASPP与KLF4之间是否存在调控关系。方法1.通过RT-PCR及Western Blot方法检测癌旁正常胃粘膜组织(20例)、不伴转移的胃癌组织(20例)、伴有转移的胃癌组织(20例)、胃癌细胞(MKN45、SGC7901、BGC823)、正常胃粘膜细胞(GES1)中iASPP的表达情况.2.选用iASPP表达水平较高的胃癌细胞株(MKN45、SGC7901),构建并向胃癌细胞株内转染iASPP的干扰慢病毒,筛选出稳定细胞株,然后用Western Blot方法检测干扰病毒转染后iASPP的表达情况。3.通过MTT、细胞克隆形成实验检测iASPP表达抑制后MKN45及SGC7901的增殖及克隆形成能力；利用流式细胞仪检测iASPP表达降低前后细胞凋亡的变化；通过Transwell侵袭及迁移实验检测MKN45及SGC7901细胞的侵袭及迁移能力的变化。4.构建裸鼠胃癌移植瘤模型,将转染iASPP干扰慢病毒的MKN45细胞及仅转染空病毒的MKN45细胞注入裸鼠皮下,观察裸鼠移植瘤的生长情况。5.通过Western Blot方法检测KLF4及iASPP在胃癌细胞株(MKN45、SGC7901)及正常胃粘膜细胞(GES1)中的蛋白表达情况,为后续试验选择KLF4及iASPP表达明显呈负相关的细胞株。6.向所选细胞株(MKN45)内转染KLF4的过表达质粒并筛选稳定细胞株,用Western Blot方法检测质粒转染后KLF4的表达情况,并同时检测iASPP的表达情况,观察iASPP的表达是否与KLF4的表达相关。向过表达KLF4的稳定细胞株内转染iASPP的过表达质粒,用Western Blot检测方法检测iASPP的表达情况。7.通过MTT、细胞克隆形成实验、流式细胞仪检测、Transwell实验检测KLF4过表达后MKN45细胞的生长增殖、凋亡、侵袭及迁移情况,以及补救实验(过表达iASPP)后,细胞的生长增殖、凋亡、侵袭及迁移情况的变化。结果1. RT-PCR及Western Blot结果表明,iASPP在胃癌细胞株(MKN45、SGC7901、BGC823)中的表达明显高于正常胃粘膜细胞(GES1)(P0.05)。与癌旁正常组织相比,iASPP在胃癌组织中的表达水平明显升高(P0.05),且伴有转移的胃癌组织中iASPP的表达水平高于不伴转移的胃癌组织(P0.05).2.根据检测结果,我们选用iASPP表达水平较高的胃癌细胞株(MKN45、SGC7901)作为后续试验对象。荧光显微镜观察结果发现,iASPP干扰慢病毒转染组的稳定细胞株内约有95%以上的细胞有较强的荧光表达。Western Blot结果显示,转染了iASPP的干扰慢病毒后,MKN45及SGC7901细胞中iASPP的表达明显降低(P0.05)。3.MTT及细胞克隆形成实验表明,抑制iASPP表达可明显抑制MKN45及SGC7901细胞的增殖及克隆形成能力(P0.05)。流式细胞仪检测结果显示,iASPP表达的降低明显促进了MKN45及SGC7901细胞的凋亡(P0.05)。Transwell实验结果表明,iASPP表达的降低还抑制了MKN45及SGC7901细胞的迁移及侵袭能力(P0.05)。4.裸鼠移植瘤实验结果显示,iASPP干扰组的裸鼠胃癌移植瘤明显小于对照组(P0.05),且Western Blot验证了iASPP干扰组的移植瘤内iASPP表达明显低于对照组。5. Western Blot检测结果显示KLF4在MKN45及SGC7901细胞中的表达明显低于正常胃粘膜细胞GES1 (P0.05),在胃癌细胞MKN45中KLF4及iASPP表达呈明显负相关,故选用MKN45作为后续试验对象。6.在MKN45中转染KLF4过表达质粒后,KLF4的表达水平明显升高(P0.05),与此同时,iASPP的表达却呈降低趋势(P0.05)。另外,向KLF4过表达的稳定细胞株内转染iASPP的过表达质粒后,iASPP的表达明显升高(P0.05)7.MTT、细胞克隆形成实验、流式细胞仪检测、Transwell实验结果显示KLF4在MKN45细胞中的表达升高后明显抑制了细胞的增殖、侵袭及迁移能力,并促进了细胞的凋亡(P0.05).补救实验结果表明,iASPP表达的恢复,又重新提高了胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力,并抑制了细胞的凋亡(P0.05)。结论1. iASPP在胃癌细胞及胃癌组织中均呈异常高表达,具有癌基因的特性,且其表达水平与胃癌是否伴有转移密切相关。2.本研究中成功构建和转染iASPP干扰慢病毒,干扰了iASPP的表达。在胃癌细胞中抑制iASPP的表达后可明显降低细胞的生长、增殖、侵袭及迁移能力,并促进细胞的凋亡。iASPP表达的降低还可抑制裸鼠体内移植瘤的生长。说明iASPP在胃癌细胞的生长增殖、凋亡、侵袭及迁移过程中发挥着重要的作用。3.KLF4在胃癌细胞中呈异常低表达,是一个抑癌基因。在胃癌细胞中过表达KLF4后,导致iASPP的表达降低,说明iASPP的表达水平与KLF4的表达有关。4.胃癌细胞中KLF4表达的升高可明显抑制细胞的增殖、侵袭、迁移能力,并可促进细胞的凋亡。而通过补救实验,提高iASPP的表达,又恢复了细胞的增殖、侵袭、迁移能力,并抑制了细胞凋亡。故推测KLF4在胃癌中发挥抑癌作用,是通过抑制iASPP的表达来实现的。5.以往研究表明HP感染可影响iASPP的表达,另外HP感染还可激活Notch信号通路,而Notch信号通路的活化又可抑制KLF4的表达。本研究证实iASPP表达与KLF4相关,且iASPP可抑制P53、P63、P73的功能。故推测HP感染→Notch信号通路活化→KLF4表达降低→iASPP表达升高→P53、P63、P73功能抑制→胃癌的形成。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : The development of gastric cancer is related to many factors , such as the activation of oncogene , the mutation of tumor suppressor gene or the inhibition of function . P53 is closely related to human tumor .
To explore the role of iASPP in the proliferation , apoptosis , invasion and metastasis of gastric cancer cells .
Methods 1 . The expression of iASPP was detected by RT - PCR and Western Blot . The expression of iASPP was detected by RT - PCR and Western Blot .
Flow cytometry was used to detect the change of cell apoptosis before and after the expression of iASPP .
The expression of KLF4 and iASPP was examined by Western Blot . The expression of KLF4 and iASPP was detected by Western Blot . The expression of iASPP in gastric cancer cells was significantly higher than that of normal gastric carcinoma ( P0.05 ) . The results of Western Blot showed that the expression of iASPP significantly inhibited the proliferation and invasion ability of MKN45 and MKN45 cells ( P0.05 ) . The results of Western Blot showed that the expression of KLF4 in MKN45 and MKN45 cells was significantly lower than that of normal gastric mucosa cells ( P0.05 ) . In gastric cancer cells , the expression level of iASPP was decreased , and the expression level of iASPP was decreased .

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

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本文编号：1759736