阻燃剂BDE-209诱导甲状腺癌发生发展的机制

发布时间：2018-04-18 07:19

本文选题：BDE-209 + TR　；参考：《山东大学》2017年硕士论文

【摘要】：滤泡上皮细胞起源的甲状腺癌(TC)是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤,城市女性第五位常见恶性肿瘤,近40年来呈明显增长趋势,其中以甲状腺乳头状癌(papillary thyroidcarcinoma,PTC)最常见。PTC的发生与碘过量、甲状腺激素(thyroid hormone,TH)内稳态失衡等有关。经典型PTC五年生存率高达95%,但高危亚型PTC以及甲状腺滤泡癌、低分化癌、未分化癌,具有较高复发率和死亡率。该类病变多伴有BRAFV600E基因突变,预后相对较差,术后激素抑制和I131治疗效果较差而容易复发和转移。因此,新型PTC致癌基因和信号通路的鉴定和机制研究将为制定更加完善的个体化治疗方案提供坚实的理论依据。十溴联苯醚(Decabromodi-phenyl ether,BDE-209)是一种溴化的阻燃剂,被称为环境内分泌干扰物(EEDs)广泛应用于家用电器、家具、纺织品中,由于PBDEs不与基质材料形成化学键,容易从产品中逸出而进入环境。BDE-209结构与三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)和甲状腺素(thyroxine,T4)及多氯联苯醚(polychlorinated biphenyls,PCBs)非常相似(图1)。有报道称雌激素代谢异常与甲状腺乳头状癌(PTC)发病相关,而研究表明,BDE-209无拟雌激素和抗雌激素活性。研究表明BDE-209可分解为小分子化合物,并且在哺乳动物体内具有毒性持久性,生物累积效应,内分泌毒性甚至实验动物的致癌性。BDE-209可能作为一种TH类似物,通过作用于甲状腺激素受体(thyroxine receptor,TR)干扰TH的内稳态。国内也有研究推断BDE-209可能干扰TH转运过程中的两个重要蛋白TBG和TH转运结合蛋白TTR,从而影响结合态T3的分离、FT4的脱碘过程,使血清T4降低并通过负反馈作用导致TSH升高。本课题拟在利用体内外实验和临床标本的检测,筛选出BDE-209诱导甲状腺肿瘤发生的靶基因,深入探讨BDE-209调控TR信号通路的分子生物学机制及其在甲状腺癌发生发展过程中的关键作用。我们前期研究发现,BDE-209显著促进人正常甲状腺滤泡上皮细胞、甲状腺癌细胞的增殖和迁移,并伴有甲状腺激素受体TR的降低;移植瘤动物模型实验显示,BDE-209可以促进肿瘤的生长和浸润;3例甲状腺疾病患者和一例正常人血液中均检测出BDE-209,其中PTC病例BDE-209浓度最高,而TR偏低;因而,我们推测BDE-209可能通过调节TR、促进细胞增殖和迁移等参与甲状腺癌的发生与进展。本研究拟通过细胞学模型、动物模型分析BDE-209与甲状腺病变及其基因学改变的关系,探索其诱导PTC发生的致瘤机制,为临床靶向治疗提供实验依据,为临床靶向治疗药物的设计和选择提供新的靶点和思路。第一部分BDE-209在正常人甲状腺滤泡上皮细胞及具有不同基因背景的甲状腺癌细胞系增殖、凋亡中的研究方法1.分别复苏并培养正常人甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori 3-1以及具有不同基因背景的甲状腺癌细胞系BHP10-3(甲状腺乳头状癌PTC,伴RET/PTC1基因突变);IHH4(甲状腺乳头状癌PTC,伴BRAFV600E基因突变);BCPAP(甲状腺乳头状癌PTC,伴BRAFV600E基因突变);8505c(间变性甲状腺癌ATC,伴BRAFV600E基因突变);TT2609(甲状腺滤泡癌FTC)。2.不同浓度 BDE-209(0.08umol/l、0.16 umol/l、0.32 umol/l、0.64 umol/l、1.25 umol/l、2.50 umol/l)分别染毒 Nthy-ori 3-124h,48h,72h,以未加药组细胞为对照组,MTS法检测BDE-209染毒后细胞的增殖率,检测细胞增殖活性。3.依据MTS检测结果绘制生长曲线,选取3个时间段中与IC50值接近的两个BDE-209浓度梯度(1.25 umol/l、2.50 umol/l)作为后续实验浓度。4.以选取的BDE-209浓度分别对具有不同基因背景的甲状腺癌细胞进行三个时间段的染毒处理,MTS法检测药物处理后各甲状腺癌细胞的增殖率及增殖活性。5.检测细胞凋亡和周期;实时定量荧光PCR法(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR),以选取浓度梯度 BDE-209(1.25umol/l,2.50 umol/l)染毒细胞72h后,检测细胞周期蛋白(cyclinA2、cyclinD1)转录产物mRNA的表达;以及浓度梯度BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)分别染毒处理各细胞系48h后,使用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)方法检测cyclinA2、cyclinD1在蛋白水平的变化。结果1.MTS细胞增殖实验结果显示:在24h时,正常人甲状腺滤泡上皮细胞Nthy ori3-1在不同浓度BDE-209染毒下的增殖具有趋势;在48h和72h不同浓度下的BDE-209染毒后Nthy ori3-1细胞增殖率变化明显,增殖效应在2.50umol/l浓度下达到最大值20%。此三组实验说明了 BDE-209促进人正常甲状腺滤泡上皮细胞增殖,且主要以慢性毒性为主,该作用具有明显的时间依赖性和剂量(0.08umol/l-2.50umol/l)依赖性。2.以选取的浓度梯度BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)染毒具有不同基因背景的癌细胞,发现:BDE-209促进甲状腺癌细胞增殖,在乳头状癌(BHP10-3,BCPAP,IHH4)、间变性癌(8505C)中较滤泡癌(TT2609)中明显,且BDE-209对甲状腺癌细胞的作用以慢性毒性为主,具有时间和剂量依赖性。3.流式细胞术(flow cytometry)检测细胞凋亡结果显示:在浓度梯度下,BDE-209染毒后,可以明显抑制正常人甲状腺滤泡上皮细胞及各甲状腺癌细胞的凋亡,其抑制凋亡作用具有统计学意义。4.流式细胞术(flow cytometry)检测细胞周期实验结果显示:BDE-209染毒后的正常人甲状腺滤泡上皮细胞G1期明显降低,但不具有统计学意义,而S期升高明显,具有明显统计学意义;在甲状腺癌细胞中,甲状腺滤泡性癌TT2609(FTC)和间变性甲状腺癌8505c(ATC),G1期明显降低,,S期显著升高,具有明显统计学意义;在甲状腺乳头状癌细胞系IHH4(PTC)中,G1期明显降低,,S期显著升高,具有显著统计学意义;而在甲状腺乳头状癌BCPAP(PTC)和BHP10-3(PTC)中,虽然G1期明显降低,S期明显升高,但都不具有统计学意义。所有细胞的细胞周期检测结果均显示,S期的细胞比率(S-phase Fraction,SPF=S/(G0/G1+S+G2/M))升高,因此表明细胞的增殖率/增殖活性升高,提示正常细胞存在恶性转化的倾向。5.qRT-PCR 和 Western Blot 结果显示,浓度梯度 BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)染毒后的正常人甲状腺滤泡上皮细胞Nthy ori3-l及所有甲状腺癌细胞的细胞周期蛋白cyclinA2、cyclinD1在mRNA水平和蛋白水平显著升高。结论1.BDE-209促进正常人甲状腺滤泡上皮细胞和所有甲状腺癌细胞增殖,具有时间依赖性和剂量依赖性。2.BDE-209通过调控细胞周期蛋白cyclinA2、cyclinD1提高细胞周期S期的比例,同时G1期比例降低,从而促进正常人甲状腺滤泡上皮细胞和所有甲状腺癌细胞的增殖,促进细胞恶性转化行为。第二部分BDE-209染毒后影响正常人甲状腺滤泡上皮细胞迁移能力、甲状腺癌细胞侵袭、迁移以及甲状腺激素受体表达量的检测方法1.选取高浓度2.50umol/l的BDE-209培养染毒正常人甲状腺滤泡上皮细胞Nthy ori3-1进行划痕实验检测正常细胞的迁移能力。2.2.50umol/l的BDE-209染毒甲状腺癌细胞,进行transwell小室实验,检测癌细胞的迁移和侵袭能力。3.实时定量荧光 PCR 法(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR),检测BDE-209(1.25umol/l,2.50 umol/l)染毒细胞72h后甲状腺激素受体(TRα、TRβ)转录产物 mRNA 的表达;以及 BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)染毒细胞48h后,蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)方法检测TRα、TRβ在蛋白水平的变化。结果1.正常人甲状腺滤泡上皮细胞染毒BDE-209划痕实验显示:BDE-209作用后的Nthy ori3-1细胞具有迁移能力。2.Transwell小室实验显示:甲状腺癌细胞经BDE-209染毒后侵袭和迁移能力均增强,具有显著统计学意义。3.qRT-PCR 和 Western Blot 结果显示,浓度梯度 BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)染毒后的正常人甲状腺滤泡上皮细胞Nthy ori3-1及所有甲状腺癌细胞的TRα、TRβ表达在mRNA水平和蛋白水平显著升高。结论1.BDE-209影响正常人甲状腺滤泡上皮细胞的迁移能力,促使正常甲状腺滤泡上皮细胞发生恶性转化。2.BDE-209促进甲状腺癌细胞侵袭、迁移能力,使癌细胞的恶性程度增加。3.BDE-209可能通过负向调控甲状腺激素受体TR α、TRβ信号转导通路,进而影响正常人甲状腺滤泡上皮细胞恶性行为转化及促使甲状腺癌细胞恶性程度增加。第三部分BDE-209染毒BALB/c雌性裸鼠皮下成瘤和尾静脉移植瘤动物模型预实验方法1.筛选并培养致瘤细胞BCPAP(甲状腺乳头状癌PTC,伴BRAFV600E基因突变)。5周龄大小BALB/c雌性裸鼠随机进行分组,每组5只:随机分成对照组(花生油组)和BDE-209超高剂量组(2000ug/(kg · d))。每只BALB/c裸鼠以终体积 0.2ml PBS(phosphate buffered saline),细胞计数为 2.0×106,制成细胞悬液注射于裸鼠两侧腋前皮下,肿瘤生成后每两日用游标卡尺测量肿瘤瘤体长径与短径,直至实验结束,绘制成裸鼠肿瘤体积指数曲线;同时,当肿瘤瘤体长径≥0.4cm(约7天)时,开始用超高剂量BDE-2092000ug/(kg·d)隔天灌胃一次,并同时测量肿瘤大小,每第二次测量肿瘤大小同时称量裸鼠体重并记录,直到实验结束,绘制裸鼠体重指数曲线。观察各组小鼠肿瘤形成情况及对照组与实验组之间肿瘤瘤体大小、体重变化的差别。2.实验结束后,分别留取实验组和对照组裸鼠的外周全血静置0.5h后,5000rpm离心20分钟收取上层血清,放-80℃保存或者立即实验室检测甲状腺功能(FT3、FT4、T3、T4、TSH、TR),对比分析。3.用0.1%戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠,分别取实验组和对照组裸鼠相关组织(肿瘤、甲状腺、肝、脾)称重,计算并比较各组织重量指数,绘制成重量指数曲线。4.将上一步骤中取下的实验组和对照组裸鼠的各组织分为两份,一份石蜡包埋,制作HE切片进行病理形态学观察,分析实验组和对照组裸鼠组织形态学上存在的差别;另一份新鲜组织液氮罐内冻存,用于组织RNA提取、总蛋白提取。5.5周龄大小BALB/c雌性裸鼠2只,以终体积0.2ml PBS,细胞计数为1.0×107,制成细胞悬液经尾静脉注射,观察裸鼠状态。结果1.持续实验过程中观察到:随着实验进展,实验组裸鼠摄食、饮水量较对照组少;活动度降低;裸鼠皮肤褶皱明显增多,皮肤颜色呈现暗褐色甚至黑褐色。2.实验组裸鼠肿瘤体积与对照组相比,初期差别不明显,随着实验进展,实验组裸鼠体肿瘤体积明显大于对照组。3.实验组裸鼠体重变化与对照组相比较,实验前期,两组裸鼠体重均呈现增加趋势,但实验组裸鼠体重增加指数明显低于对照组;实验中后期,实验组与对照组裸鼠体重均呈现下降趋势,且实验组裸鼠体重降低指数明显超过对照组。4.在实验过程中,BDE-209灌胃组小鼠饮食量、饮水量较对照组明显降低;实验后期,实验组小鼠状态明显差于对照组,且皮肤颜色呈现蓝黑色。5.血清检测甲状腺功能由于裸鼠血液提取量低,结果未测得。6.尾静脉裸鼠于实验第7天开始出现体重下降,饮食、饮水量下降,精神状态下降,皮肤颜色呈现暗褐色,且变化时间早于实验组小鼠,裸鼠于实验第14天发生死亡。结论1.BDE-209可以加速皮下移植瘤的生长速度,促进甲状腺癌细胞的恶性进展。2.BDE-209影响小鼠行为学和精神状态改变。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R736.1

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