TET3介导5hmC改变及BRAF修饰对甲状腺乳头状癌作用

发布时间：2018-04-21 03:05

本文选题：甲状腺乳头状癌 + BRAF突变5hmC　；参考：《天津医科大学》2017年博士论文

【摘要】：甲状腺癌占甲状腺结节的7%-15%,是最常见的内分泌肿瘤。其中甲状腺乳头状癌占有越来越大的比例,鉴于当前的患者数量,且该数量仍在迅速增加,需要制定有效诊治甲状腺癌的策略。常规的临床病理学评估是目前为甲状腺癌患者进行风险分层的基础,主要临床病理因素包括患者年龄、性别、肿瘤直径、腺外侵袭、淋巴结转移、远处转移和晚期肿瘤。但上述传统临床病理指标并不能有效精准地识别侵袭性较高的甲状腺癌。当前针对甲状腺乳头状癌的最佳预测指标及诊治指南仍存在争议,在这种情况下,针对分子机制以及分子靶向药物领域的研究便有了巨大的进步。BRAF突变是甲状腺癌中常见的体细胞突变,在约45%的甲状腺乳头状癌中发生此突变。BRAF可以激活MEK引起下游MAPK通路产生效应。但BRAF发挥作用的途径也许不只是通过碱基突变等常规遗传学改变,近年来越来越多的研究将重点放在表观遗传学修饰上。表观遗传学修饰能产生可遗传的基因表达或细胞表型的变化,且不会对DNA序列产生影响。DNA甲基化是当前研究最广泛的表观遗传修饰,一般发生在Cp G位点基因中,然而在富含胞嘧啶和鸟嘌呤的Cp G岛则反而未被甲基化,而大部分基因表达的启动子就位于此区域,暗示甲基化和肿瘤之间存在相关性。5m C是基因组中最丰富的Cp G修饰,其通常与基因沉默相关。而TET家族的发现以及其催化生成的5m C氧化产物,使得关于这种表观遗传学修饰的研究越来越多,其逆转DNA甲基化以及调节转录功能的作用渐渐被发现。本研究选取50例患者纳入研究,将患者临床病理特征汇总后与BRAF测序结果进行相关性分析,发现BRAF~(V600E)突变与腺外侵袭和淋巴结转移等因素相关。随后将5hm C染色结果与临床病理特征也进行相关性分析,发现5hm C羟甲基化水平作为临床指标的特异度及灵敏度更高,初步提示了5hm C作为临床预测指标的价值,并引导本研究继续探讨去甲基化在乳头状癌发生、发展中的作用。在新鲜组织中,本研究从DNA水平通过斑点杂交发现甲状腺乳头状癌基因组DNA的5hm C水平明显升高,进而通过实时荧光定量PCR及蛋白质电泳从RNA及蛋白质水平发现,调控5hm C代谢的羟甲基化酶TET家族中的TET3表达升高。在体外实验中,本研究通过小分子干扰RNA阻遏TET3在甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1及B-CPAP中的表达,免疫荧光实验证明TET3表达降低可使羟甲基化水平降低,同时CCK-8、Transwell及划痕实验发现TET3降低后甲状腺乳头状癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力下降。由于TPC-1和B-CPAP分别为BRAF野生型和BRAF~(V600E)突变型细胞系,两组细胞系之间结果并无明显差异,说明TET3发挥其去甲基化作用进而影响细胞功能,并不受BRAF突变的影响,其表观遗传学修饰与碱基突变分别从不同水平对细胞产生影响。CRISPR/Cas系统是原核生物的免疫系统,通过获得免疫的形式给予原核生物抵抗外源性遗传物质的能力,通过对CRISPR/Cas系统进行改造,将人工合成的g RNA与Cas9核酸酶的复合物转入细胞后,可以在指定基因组位点进行切割,从而实现基因的敲除或引入,这种方法可以简单高效地靶向基因组中的特定DNA序列,从而能够快速发现新的基因功能、开发新的细胞和动物疾病模型,并且在肿瘤治疗领域取得实质性进展。本研究将CRISPR/Cas9应用于甲状腺乳头状癌中,探究羟甲基化酶TET影响甲状腺乳头状癌细胞的机制。首先利用CRISPR/Cas9技术建立TET3稳定敲除的BRAF野生型甲状腺乳头状癌TPC-1细胞系,并向这株细胞中过表达野生型BRAF。TET3敲除组TPC-1细胞与对照组相比,其去甲基化水平、侵袭、增殖和迁移能力均有不同程度的降低,而当在TET3敲除组TPC-1细胞中过表达BRAF后,可以观察到肿瘤细胞的侵袭、增殖和迁移能力都有一部分回复。与此同时,本研究在BRAF突变型细胞系B-CPAP中重复上述试验并观察到相同的结果。Ch IP-q PCR分析发现TET3可以结合到野生型和突变型BRAF基因的启动子区,调控BRAF的表达。说明TET3促进肿瘤发生发展的过程中,至少部分依赖于BRAF的活性。
[Abstract]:In this study , 50 patients with thyroid papillary carcinoma have been identified as the most abundant epigenetic modification of thyroid carcinoma . In this study , we used the CRISPR / Cas9 technique to establish the novel gene function , develop new cell and animal disease models , and observe the same results .

【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R736.1

【相似文献】