基于纳米基因传递系统的直接重编程：诱导分化成肝脏样细胞的研究

发布时间：2018-04-21 06:46

本文选题：直接重编程 + 磷酸钙纳米粒　；参考：《江苏大学》2016年硕士论文

【摘要】：近年来,肝癌成为了继心脑血管疾病之后的又一威胁人类生命安全的重大疾病。我国的肝癌发病率一直居高不下,而肝脏移植仍是主要的治疗手段。但由于肝源的短缺以及患者自身的生理状况,术后的情况往往不是很理想。“细胞替代治疗法”概念的问世,给患者带来了希望。但同样的,肝细胞移植替代肝脏移植,供体肝细胞的来源仍是一个问题,即使是单纯的获取肝脏细胞,对人体也有很大的创伤性。本课题以磷酸钙纳米粒为基因载体,携带外源性的肝脏相关基因,体外直接重编程肝脏样细胞,高效地产生“供体肝脏细胞”,继而解决肝脏细胞短缺的问题。全文主要由以下5个章节构成。第一章综述本章节主要围绕肝癌的现状(产生原因,临床治疗手段等),现阶段对于体外肝脏样细胞重编程的现状以及目前对于基因载体的应用的概括。为后续的研究提供理论依据。第二章磷酸钙纳米粒的制备及表征主要介绍携带外源性肝脏相关基因的磷酸钙纳米粒的制备及其理化性质的表征。首先,通过琼脂糖电泳法确定质粒是否被磷酸钙包裹;随后,采用粒径分析仪和透射电镜(TEM)分别测定所制备的磷酸钙纳米粒的粒径大小,分布,Zeta电位以及微观形态;最后,通过MTT法来考察纳米粒的细胞毒性。研究结果表明,扫描电镜下观测纳米粒子呈现较均一的球形,平均粒径在50nm左右,和粒径分析仪的结果相符。Zeta电位在+3.89m V左右,与电泳图的结果一致,细胞毒性试验说明所制备的磷酸钙纳米粒是无毒或低毒的。第三章人脐带间充质干细胞的直接重编程以人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)为种子细胞,进行体外肝脏样细胞的诱导分化。首先,分别将已经制备好的含质粒的5种磷酸钙纳米粒进行外源基因的瞬时转染,连续转染4次后,用3种诱导培养基分别进行细胞的诱导分化培养。采用酶联免疫试剂盒(ELISA KIT)分别检测细胞在第0天,7天,14天,21天,25天时AFP,ALB的表达情况,来确定最佳的质粒组合以及培养基类型。结果显示:“最佳”的质粒组合是Hnf4α,Foxa1,Foxa2,Foxa3,“最佳”的培养基是mediumⅢ,即先对细胞给予高浓度的Activin A(100ng/m L),继而添加a-FGF,TSA,HGF,EGF,Dex,OSM等有助于肝脏诱导分化为肝脏的物质。细胞的表观形态显示,脐干细胞已由原来的长梭状,变成类似的肝脏细胞多角形,细胞核突出,部分出现双核现象。ELISA结果显示,在诱导的第7天左右,最大程度的表达AFP,并在14天左右,AFP不再表达。而ALB则在第14天左右才开始表达,且随时间的延长,表达量增加,直到25天左右,表达量趋于恒定。研究结果表明,通过实验筛选肝脏直接重编程的最佳组合能成功使人脐带干细胞直接重编程为肝细胞。第四章大鼠胚胎成纤维细胞和小鼠间充质干细胞的直接重编程主要是对上一章节建立的“最佳质粒组合和培养基”的方法学进行验证,以大鼠胚胎成纤维细胞(REF)和小鼠神经脊来源的间充质干细胞(EMSC)作为候选者,进行体外肝脏样细胞的直接重编程。通过SDS-PAGE蛋白电泳,免疫荧光,ELISA试剂盒等实验对肝脏的代表性功能进行检测,包括相关蛋白(AFP、ALB、CK18)的表达,合成尿素的量,消耗葡萄糖的量以及相关酶(AST、ALT、LDH)的活性,以进一步验证方法学的通用性。结果显示:REF和EMSC的形态均发生明显的变化,都由原来的长梭形变成了椭圆形,部分细胞出现了“铺路石”样,且细胞核/胞浆的比值明显变小,甚至出现双核或者多核的现象。在诱导分化期间,Western Blot和细胞免疫荧光结果表明:诱导分化组的肝脏相关特异性蛋白(AFP、ALB、CK18)的表达量较空白组均显著表达,且尿素的合成量和葡萄糖的消耗量都随着培养时间的延长而增加,呈现一定的时间依赖性。ELISA试剂盒检测的AST,ALT和LDH的含量都暗示着类肝脏细胞的活力在整个过程中都没有很大的波动。研究表明,大鼠胚胎成纤维细胞核小鼠间充质干细胞均可直接重编程为具有肝脏相关特性的类肝脏细胞。第五章3D体系下,EMSC的肝脏细胞的直接重编程以EMSC为种子细胞,选用壳聚糖和纤维胶原制备的支架材料,建立EMSC三维培养体系。采用扫描电镜观察支架的微观形态以及细胞在支架上的生长状态;MTT间接地考察EMSC在支架上的增值状况。采用细胞免疫荧光法,化学检测以及ELISA试剂盒等检测肝脏相关蛋白(AFP、ALB、CK18),肝功能(尿素的合成,葡萄糖的消耗量)以及肝脏相关酶的活性(AST、ALT、LDH)检测三维条件下肝细胞直接重编程效果,并与单层培养相比较。结果显示:扫描电镜下所制备的纤维胶原支架以及纤维胶原和壳聚糖的混合支架均呈现疏松多孔多层次的结构,2种支架的孔径均在100μm左右,且细胞很好的粘附在支架上。MTT实验发现:由于三维体系的存在,单位面积中支架上培养的细胞的密度更大,且增殖更明显。与二维细胞相比,三维培养的细胞经诱导分化后,肝脏相关因子(AFP,ALB,CK18)都高表达,且尿素合成,消耗葡萄糖的能力等肝功能活性都高于二维培养。肝脏相关酶活性的ELISA试剂盒显示:壳聚糖/胶原支架的三维体系,直接重编程效果明显优于单纯胶原支架,且直接重编得到的类肝脏细胞的功能良好,肝脏相关蛋白表达明显高于单层细胞培养。
[Abstract]:In recent years , liver cancer has been a serious disease threatening human life safety following cardiovascular and cerebrovascular diseases . The incidence of liver cancer in China has been high , and liver transplantation is still a major therapeutic method . the best " plasmid combination is Hnf4 alpha , Foxa1 , Foxa2 , Foxa3 , The results showed that the direct reprogramming of fetal fibroblasts ( REF ) and mesenchymal stem cells ( MSC ) in rat embryonic fibroblasts ( REF ) and mouse nerve ridge had changed significantly . The results showed that the three - dimensional structure of liver cells and the activity of liver - related enzymes ( AFP , ALB , CK18 ) , liver function ( synthesis of urea , consumption of glucose ) and the activity of liver - related enzymes ( AST , ALT , LDH ) were higher than that in the two - dimensional culture .

【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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