抗OX40单抗研制及抗CD47单抗联合用药探究

发布时间：2018-04-22 18:58

  本文选题：OX40 + CD47　； 参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年硕士论文

【摘要】：肿瘤免疫治疗是目前单克隆抗体的一个主要发展方向。以PD1-PDL1通路为代表的免疫检查点抗体在临床上的巨大成功使更多的与免疫细胞激活相关靶点的抗体药物的研发成为热点。其中,OX40、CD47两个免疫系统相关分子,被逐步验证可以作为有效的治疗性抗体靶点。OX40(又称CD134、TNFRSF4、ACT35)是表达于活化的CD4+T、CD8+T细胞表面的激活性受体。OX40信号可以激活下游的NF-κB、PI3K和PKB通路,这些通路的持续激活最终能够延长T细胞的存活,促进T细胞的增殖。OX40广泛表达于慢性炎症及肿瘤部位的T细胞上。其配体OX40L能够促进B细胞的活化及抗体产生。两者能在活化的T细胞和B细胞之间进行双向信号转导,具有强大的生物学功能。因此,研发抗OX40抗体对肿瘤治疗具有重要的现实意义。CD47(又称整联蛋白、卵巢癌标志物)是表达于多种肿瘤细胞表面并作用于巨噬细胞及DC细胞的免疫检查点分子,通过与巨噬细胞表面的SIRPα结合向其传递“Don′t eat me”信号,实现免疫逃逸。阻断CD47-SIRPα通路可以促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬,同时还可以提高肿瘤特异性抗原的免疫递呈,激活特异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤,达到同时激活固有免疫和获得性免疫应答的效果。本课题主要围绕免疫抗肿瘤抗体药物的发现和评价,一方面尝试利用大容量抗体库筛选技术获得抗OX40激动型抗体,为肿瘤的免疫治疗提供新的候选分子;另一方面针对已经获得的一株抗CD47功能抗体,探索其与其它靶向抗体联合抗肿瘤的应用。本课题的第一部分是围绕免疫抗肿瘤抗体药物的发现,以T细胞表面共刺激分子OX40为靶点,筛选抗OX40单抗并进行初步鉴定。依托已构建的大容量全合成全人源噬菌体单链抗体库平台,以OX40为抗原进行多轮多次的固相筛选。经过3轮条件渐进严苛的筛选后,得到8株阳性克隆,其中一株得到极好的富集;所有阳性克隆通过基因工程改造成全抗体形式,形成重组质粒。重组质粒按照一定的比例转染HEK293-F细胞进行全抗体的瞬时表达;并基于AKTA系统对全抗体进行纯化。之后分别通过以下方法验证了全抗体的特性。第一,通过ELISA验证了全抗体与抗原OX40在分子水平上的结合活性;第二,通过间接免疫荧光验证了全抗体与细胞表面抗原的结合活性;第三,通过流式细胞术验证了全抗体与细胞表面抗原的结合活性和特异性;第四,采用ELISA方法测定了全抗体的特异性;第五,通过血清放置实验验证了全抗体的血清稳定性;第六,通过BIAcore TM3000初步测定了全抗体亲和力。实验结果显示,通过3轮噬菌体单链抗体库固相筛选后,得到8株阳性单链抗体,scFv-1在筛选过程中富集率达到了95%;8株中有5株顺利改造成全抗体并表达纯化。对各抗体分子的特性进行探究发现,OX40mab-4、OX40mab-8与抗原的结合活性较差,OX40mab-5、OX40mab-6的特异性较差,因此这4株抗体在鉴定过程中被逐渐淘汰。相比于其他4株抗体,OX40mab-1具有较好的结合活性,与OX40结合的EC50为0.015μM,特异性、血清稳定性也较好,亲和力为251 nM。因此确定OX40mab-1作为后续研究的候选抗体分子。本课题的第二部分是围绕免疫抗肿瘤抗体药物的评价,以本室已获得的一株高亲和力全人源抗CD47特异性抗体AMMS4-G4为研究对象,探究该抗体在肿瘤模型体内联合其他靶向抗体的药效。该抗体可以阻断CD47-SIRPα的结合,并且能够有效促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。体内试验已证实该抗体独立给药时,能够显著延长白血病模型小鼠的生存期,有效清除模型动物体内的白血病细胞;因此,本课题基于以上研究背景,探究了AMMS4-G4在肿瘤小鼠模型中联合其他靶向抗体联合用药的药效,期望能够探索出此抗体在肿瘤应用中的新方法,为临床治疗奠定基础。本课题选择了三种联合靶向抗体:A2C1、Herceptin和Rituximab。A2C1是本室获得的另一株靶向人EGFR的阻断型抗体,正在开展针对人结直肠癌的临床试验;Herceptin是一株靶向人HER2的人源化单抗,临床上主要用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌;Rituximab是一株靶向人CD20的人鼠嵌合单抗,临床上主要用于治疗CD20阳性的非霍奇金淋巴瘤。基于AMMS4-G4和上述三种靶向抗体的特性,本课题构建了以下肿瘤动物模型。分别是同时表达人CD47和EGFR的人结肠癌细胞Lovo荷瘤裸鼠模型;同时表达人CD47和HER2的人卵巢癌细胞Skov3荷瘤裸鼠模型;同时表达人CD47和CD20的淋巴瘤Raji肿瘤模型,分别用于考察AMMS4-G4和A2C1、Herceptin和Rituximab联合用药的治疗效果。抗CD47治疗性抗体联合用药药效评价主要从以下几个方面展开。第一,通过流式细胞术检测了抗体与肿瘤细胞表面相关抗原的结合;第二,小鼠接种肿瘤细胞、分组、建立荷瘤小鼠模型;第三,建模成功的荷瘤小鼠模型分组给药、测量肿瘤体积、观察临床症状;第四,根据肿瘤生长情况,停止给药并继续观察,对小鼠实施安乐死,对肿瘤重量进行统计学分析,并评价联合用药药效结果。第五,初步探究荷瘤小鼠模型联合用药的药效学机制。实验结果显示,在Lovo荷瘤裸鼠模型上,低剂量(即12.5 mg/kg)A2C1、AMMS4-G4联合给药时相比A2C1、AMMS4-G4任一抗体单独给药肿瘤重量明显下降,肿瘤体积明显减小,说明联合用药具有更好的药效;同时,高剂量(即25 mg/kg)A2C1、AMMS4-G4联合给药组虽然与A2C1单给药组统计学差异不明显,但仍可见有更好的抑瘤趋势。对A2C1、AMMS4-G4的联合用药机制进行探究发现,抗EGFR抗体A2C1有可能协同抗CD47抗体AMMS4-G4下调Lovo肿瘤组织中CD47的含量;同时研究还发现,AMMS4-G4可能具有与A2C1同样的肿瘤组织内蓄积作用。在Skov3荷瘤模型中,虽然Herceptin、AMMS4-G4联合给药相比Herceptin、AMMS4-G4任一抗体单独给药药效并无显著改善,但从趋势上讲联合用药仍具有一定优势,而且研究还发现AMMS4-G4单用时药效显著好于对照抗体huIgG,与商业化抗体Herceptin药效相当。同样在Raji荷瘤模型中,AMMS4-G4单用时药效良好,且能够显著抑制肿瘤细胞向骨髓转移。综上所述,本课题在抗肿瘤单抗药物的发现和评价方面做了两方面工作,第一,筛选靶向T细胞表面的共刺激分子OX40的单克隆抗体。通过3轮筛选后得到一株与抗原结合活性较好,特异性、血清稳定性较好,亲和力为251 nM的抗OX40单抗分子,为肿瘤免疫治疗提供新的候选分子。第二,针对已经获得的一株抗CD47功能抗体AMMS4-G4,探索其与其他靶向抗体联合用药时在肿瘤动物模型上的药效,体内试验显示,在Lovo荷瘤模型中A2C1联合AMMS4-G4同时给药相比任一抗体单独给药都具有更好的药效,其药效机制有可能是A2C1协同AMMS4-G4下调Lovo肿瘤组织中CD47的含量。而在Skov3、Raji荷瘤模型中,AMMS4-G4单用时药效良好。这为AMMS4-G4在抗肿瘤免疫治疗方面提供了用药指导。
[Abstract]:Anti - OX40 ( CD47 - SIRSF4 , ACT 35 ) is an active receptor for the treatment of tumor cells . This study was conducted to investigate the effect of AMMS4 - G4 on tumor cells . The second part of this study was to investigate the effect of AMMS4 - G4 on tumor cells . The results showed that the effect of AMMS4 - G4 on tumor animal model was better than that of A2C1 and AMMS4 - G4 . The results showed that AMMS4 - G4 had better effect compared with that of A2C1 and AMMS4 - G4 . The effect mechanism of AMMS4 - G4 has been proved to be good when AMMS4 - G4 is used alone in the treatment of anti - tumor immunotherapy .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.5
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本文编号：1788494