CIP2A在genistein和lapatinib抗乳腺癌中的作用

发布时间：2018-04-24 07:33

本文选题：乳腺癌 + genistein　；参考：《郑州大学》2016年博士论文

【摘要】：乳腺癌是最常见的威胁女性的癌症之一,并且它的全球发生率还在不断增加。重要的是,乳腺癌是女性癌性相关死亡中第二大死亡原因,在美国约占所有女性癌症相关死亡的15%。有效治疗和预防这种病态的疾病仍然是个重大的挑战。运用天然化合物对乳腺癌的预防和治疗仍然是乳腺癌研究的主要工作之一。CIP2A是蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A,CIP2A),是在2007年最新发现的致癌基因。CIP2A能够抑制PP2A,通过活化AKT并抑制PP2A诱导的对癌性蛋白c-Myc的去磷酸化作用,从而稳定c-Myc蛋白的水平,并参与促进癌细胞的增殖、转化和细胞周期的调控过程,抑制放化疗所诱导的癌细胞凋亡的发生。CIP2A在人的多种良性组织样本中是呈现低表达的,而在乳腺癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤组织中却呈现高表达。研究表明CIP2A与临床病理参数和预后有一定关系。那么CIP2A能否成为乳腺癌的潜在治疗靶点以及其与抗乳腺癌药物之间的相互调节与作用机制等方面还有待进一步研究。Genistein(染料木素)是大豆异黄酮的主要成分之一,是一种天然的化合物,其活性强,具有植物雌激素和酪氨酸激酶抑制剂的特性。已有研究证明,高摄入量的大豆与降低乳腺癌风险率相关联。尽管genistein介导的抗肿瘤研究取得了一些进展,但其作用机理仍不十分清楚。本实验中,我们研究了genistein在用于抗乳腺癌治疗时对CIP2A的调节作用。首先,通过MTT和western blot的结果提示CIP2A对genistein诱导的生长抑制和凋亡有功能性的影响,进一步证实了genistein可以诱导CIP2A在乳腺癌细胞MCF-7-C3和T47D中表达下调,并与genistein诱导的乳腺癌细胞生长抑和凋亡活动有关。我们研究发现,乳腺癌细胞中CIP2A过表达可以减弱genistein诱导的乳腺癌细胞生长抑制和凋亡活动;反之,当CIP2A的表达沉默后,则增加其对genistein诱导的乳腺癌细胞生长抑制和凋亡的敏感性。我们进一步验证了genistein诱导的CIP2A下调机制既包含了转录水平抑制又包含了蛋白酶体降解过程。特别的是,高浓度的genistein可以一并诱导E2F1和CIP2A的下调。且高表达的E2F1减弱了genistein诱导的CIP2A在m RNA水平的下调,这表明E2F1从转录水平上抑制了genistein诱导的CIP2A下调。综上所述,在这部分实验中证实了CIP2A可以作为genistein的功能作用靶点,且E2F1介导的CIP2A转录水平的调节导致了CIP2A在蛋白水平的下调。我们的实验数据提高了对genistein诱导的生长抑制和凋亡活动的理解,提示CIP2A在乳腺癌抗癌相关试剂研究方面可以作为一个药物作用靶点。ErbB2为表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)家族成员之一,约1/3左右的乳腺癌患者被检测到体内癌细胞中ErbB2基因的过量表达。Lapatinib(拉帕替尼)是ErbB2和EGFR的小分子抑制剂,已被用于ErbB2过度表达的乳腺癌治疗,然而lapatinib的耐药性已成为临床应用难题。我们在实验中发现沉默乳腺癌耐药细胞(lapatinib resistent,LR)BT474/LR中的CIP2A之后,对lapatinib所诱导的生长抑制和凋亡的敏感性增加。表明CIP2A是lapatinib的一个关键性抑制因子,有助于临床上对lapatinib所诱导的抗肿瘤活性和耐药性的研究,以进一步证明CIP2A调节可以作为抗乳腺癌试剂方面研究的一个有效药物作用靶点。第一部分Genistein作用乳腺癌细胞后CIP2A表达变化目的检测genistein作用于乳腺癌细胞MCF-7、MCF-7-C3和T47D后CIP2A的蛋白水平表达,以及genistein对乳腺癌细胞的生长抑制和凋亡活动的影响。方法1.选用实验室构建的Caspase3稳定表达的MCF-7/Caspase3(MCF-7-C3)细胞株,Western blot检测经不同浓度genistein处理后乳腺癌细胞MCF-7、MCF-7-C3和T47D中的CIP2A、PARP/cleaved PARP、caspase-3、cleaved caspase-3的表达水平变化。2.采用MTT比色分析法检测不同浓度genistein(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM,60μM)对乳腺癌细胞MCF-7-C3和T47D增殖的影响。3.用流式细胞仪分析genistein处理乳腺癌细胞MCF-7-C3和T47D前后对细胞周期分布的影响。结果1.Genistein对乳腺癌细胞MCF-7、MCF-7-C3和T47D中的CIP2A蛋白表达有下调的作用,且随着genistein浓度的升高,对CIP2A蛋白的下调作用增强;通过western blot检测凋亡蛋白表达水平显示,genistein可以引起明显的凋亡活动,减少总caspase-3蛋白水平的表达,增加caspase-3和PARP的切割带产生。提示genistein诱导的CIP2A下调与总caspase-3水平的下降、caspase-3和PARP的切割带升高有关,即genistein介导的CIP2A蛋白水平的下调与其诱导的乳腺癌细胞凋亡活动有关。2.MTT结果显示,genisten(?10μM)对乳腺癌细胞MCF-7-C3和T47D有生长抑制作用,且呈浓度依赖性。3.流式细胞仪分析细胞周期分布显示,与各对应细胞株的对照组相比,genistein可以使乳腺癌细胞MCF-7-C3和T47D在G0/G1期发生阻滞。结论Genistein可以下调癌基因CIP2A的蛋白表达,其介导的CIP2A下调活动可能与genistein诱导的乳腺癌细胞生长抑制和凋亡活动发生有关。第二部分CIP2A过表达减弱乳腺癌细胞对genistein的敏感性目的为了研究CIP2A过表达是否减弱乳腺癌细胞对genistein的药物敏感性,即CIP2A过表达减弱genistein诱导的乳腺癌细胞生长抑制活动和凋亡的发生。方法1.用CIP2A过表达编码的慢病毒分别感染乳腺癌细胞株MCF-7-C3和T47D,对照组感染空载质粒。经筛选后获得稳定混合克隆细胞株,经Western blot检测,对各个稳定克隆细胞株CIP2A蛋白的表达情况进行鉴定。2.MTT检测genistein对稳定克隆细胞株MCF-7-C3/CIP2A、T47D/CIP2A和各对照组细胞增殖的影响。3.流式细胞仪检测genistein对稳定克隆细胞株MCF-7-C3/CIP2A、T47D/CIP2A和各对照组细胞的细胞周期分布的影响。4.ELISA检测genistein对稳定克隆细胞株MCF-7-C3/CIP2A、T47D/CIP2A和各对照组细胞的凋亡影响。5.Western blot检测genistein对稳定克隆细胞株MCF-7-C3/CIP2A、T47D/CIP2A和各对照组细胞CIP2A蛋白水平表达和凋亡蛋白PARP的影响。结果1.经过筛选和Western blot鉴定,获得稳定CIP2A过表达的乳腺癌细胞株MCF-7-C3和T47D,分别命名为MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A细胞。2.MTT细胞增殖实验结果显示,稳定克隆细胞株MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A经过genistein不同浓度(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM,60μM)处理5天后,与各自的对照组细胞相比,genistein对CIP2A过表达乳腺癌细胞MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A的生长抑制作用明显减弱。3.流式细胞仪分析细胞周期分布结果显示,在CIP2A过表达细胞株MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A中,与对照组细胞相比,CIP2A过表达减缓了genistein诱导的乳腺癌细胞在G0/G1期的阻滞情况。4.ELISA凋亡分析数据显示,与各自对照组相比,CIP2A过表达减缓了genistein诱导的乳腺癌细胞凋亡的发生。5.Western blot检测各组细胞的CIP2A蛋白和凋亡蛋白水平表达变化结果显示,与相应的对照组相比,genistein对CIP2A过表达细胞株MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A中的CIP2A蛋白水平的下调作用减弱,即genistein对CIP2A过表达的细胞株MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A的敏感性降低;相应地,genistein对它们的凋亡蛋白PARP切割带的产生也随之减少,提示genistein诱导CIP2A过表达的乳腺癌细胞株的凋亡活动减弱。结论CIP2A过表达减弱genistein介导的乳腺癌细胞生长抑制和凋亡活动的发生。第三部分CIP2A沉默促进乳腺癌细胞对genistein的敏感性目的为了研究CIP2A沉默是否增加genistein的药物敏感性,即CIP2A沉默增强genistein诱导的乳腺癌细胞生长抑制和凋亡的发生。方法1.实验中采用CIP2Ash RNA编码的慢病毒感染MCF-7-C3和T47D细胞,对照组感染空载质粒。Western blot检测筛选后的稳定克隆细胞株在CIP2A蛋白水平的表达。2.MTT细胞增殖实验结果显示,稳定克隆细胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A经过genistein不同浓度处理5天后,与各自对应的对照组相比,genistein对MCF-7-C3/si CIP2A、T47D/si CIP2A乳腺癌细胞的生长抑制作用增加。3.流式细胞仪分析细胞周期分布情况显示,在MCF-7-C3/si CIP2A、T47D/si CIP2A细胞株中,与对照组相比genistein增加了CIP2A沉默的乳腺癌细胞MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A在G0/G1期的阻滞情况。4.ELISA分析细胞凋亡数据显示,与各自相应的对照组相比,genistein增加了CIP2A沉默的乳腺癌细胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A细胞凋亡的发生。5.Western blot检测各组细胞的CIP2A蛋白和凋亡蛋白水平表达变化结果显示,与相应的对照组相比,genistein对CIP2A沉默细胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A中的CIP2A蛋白水平的下调作用增加,即genistein对CIP2A沉默细胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A的敏感性增强;genistein促进了CIP2A沉默细胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A中的PARP的切割带的产生,提示genistein介导的CIP2A沉默的乳腺癌细胞的凋亡活动加强。结果1.经过puromycin筛选和Western blot鉴定,获得稳定CIP2A沉默细胞株MCF-7-C3和T47D,分别命名为MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A。2.MTT比色分析结果显示,稳定克隆细胞MCF-7-C3/si CIP2A、T47D/si CIP2A经genistein处理5天后,与对应的对照组相比,genistein促进了CIP2A沉默细胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A的生长抑制。3.流式细胞仪分析细胞周期分布情况显示,在CIP2A沉默细胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A中,genistein增加了乳腺癌细胞G0/G1期的阻滞。4.ELISA分析细胞凋亡数据显示,与相应的对照组相比,genistein促进了CIP2A沉默细胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A的凋亡发生。5.Western blot结果显示,与相应的对照组相比,genistein促进了乳腺癌细胞MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A中CIP2A蛋白水平的下调,且PARP的切割带也随之增加。即genistein对CIP2A沉默的乳腺癌细胞株敏感性增加。结论CIP2A沉默的乳腺癌细胞增加了genistein介导的乳腺癌细胞生长抑制和凋亡活动的发生。第四部分Genistein诱导CIP2A下调的分子机制目的从转录水平和蛋白酶体通路水平探讨genistein下调CIP2A的作用机制。方法1.Genistein处理乳腺癌细胞MCF-7-C3和T47D后,采用实时荧光定量PCR技术分析genistein对乳腺癌细胞的CIP2A m RNA水平的调节。2.Genistein处理乳腺癌细胞MCF-7-C3和T47D细胞后,合并或不合并蛋白酶体抑制剂MG132继续培养24h,然后采用Western blot分析对CIP2A蛋白表达水平的影响。3.由于CIP2A蛋白的稳定性受到Akt活性的调节,我们在实验中用genistein处理乳腺癌细胞后,采用Western blot检测乳腺癌细胞MCF-7-C3和T47D在p-Akt的蛋白水平变化;E2F1是调控CIP2A转录水平变化的一个重要转录因子,在实验中我们用genistein处理乳腺癌细胞MCF-7-C3和T47D后,用Western blot检测了E2F1的蛋白表达水平变化,旨在研究E2F1在genistein介导的CIP2A转录调节中的作用。4.扩增、收取重组E2F1腺病毒,用重组腺病毒E2F1感染MCF-7-C3和T47D细胞后,再用genistein处理各组乳腺癌细胞,经Western blot检测感染腺病毒E2F1后,genistein对乳腺癌细胞中E2F1、CIP2A和c-Myc的蛋白水平调节。5.采用腺病毒E2F1感染MCF-7-C3和T47D细胞,我们将不同的E2F1表达水平的乳腺癌细胞经genistein处理后,检测乳腺癌细胞CIP2A在m RNA水平表达变化。结果1.实时荧光定量PCR检测结果显示,在乳腺癌细胞MCF-7-C3和T47D中用25μM或50μM genistein处理过后的CIP2A的m RNA水平明显下降;且在低浓度的genistein处理后的乳腺癌细胞中CIP2A的m RNA水平有了轻度的升高。这种剂量依赖式模式变化与我们前面研究的genistein对CIP2A在蛋白水平变化相一致。2.Western blot结果发现经过用蛋白酶抑制剂MG132处理后的细胞可以明显逆转genistein所诱导的CIP2A在蛋白水平的下调。3.Western blot显示在genistein处理后的乳腺癌细胞中Akt的活性受到抑制;转录因子E2F1也随着CIP2A在蛋白水平的下调而也呈剂量依赖式下调。4.Western blot分析显示,乳腺癌细胞中E2F1过表达可以减弱genistein诱导的CIP2A蛋白水平的下调和c-Myc蛋白下调的表达。5.实时荧光定量PCR分析提示,乳腺癌细胞中E2F1过表达可以引起CIP2A在m RNA水平显著升高,经genistein处理之后又随之下降。提示E2F1在这两种乳腺癌细胞系中的过表达可以减弱genistein诱导的CIP2A在m RNA水平的下调。结论Genistein诱导的CIP2A转录水平的抑制与CIP2A的蛋白水平下调有关且受到蛋白酶体通路的调节;genistein诱导的CIP2A在蛋白水平发生的下调导致乳腺癌细胞中Akt的活性受到抑制;转录因子E2F1在genistein诱导的CIP2A m RNA水平下调中起关键作用,这一变化导致了整个CIP2A在蛋白水平的下调。第五部分CIP2A调节在lapatinib耐药细胞中的作用目的检测CIP2A沉默后BT474/LR细胞对lapatinib的敏感性变化,探讨CIP2A在lapatinib耐药性(LR)乳腺癌细胞中的作用,方法1.采用本实验室已建好的lapatinib耐药细胞株BT474/LR,用MTT比色分析验证BT474和BT474/LR乳腺癌细胞对lapatinib的不同敏感性。2.分析lapatinib对乳腺癌细胞BT474和BT474/LR中CIP2A蛋白表达水平的影响。3.以CIP2Ash RNA编码的慢病毒感染BT47/LR细胞,筛选和建立有效CIP2A沉默的稳定克隆细胞株BT474/LR/si CIP2A。4.以MTT比色分析检测BT474/LR中CIP2A沉默对lapatinib敏感性作用。5.ELISA分析lapatinib对BT474/LR和BT474/LR/si CIP2A细胞凋亡的影响。6.Lapatinib处理BT474/LR和BT474/LR/si CIP2A细胞后,Western blot分析各组细胞在CIP2A、PARP、caspase-3和cleaved caspase-3(c-caspase-3)蛋白水平的表达。7.Lapatinib处理BT474/LR和BT474/LR/si CIP2A细胞后,Westernblot分析lapatinib对各组细胞CIP2A、p-Akt和Akt蛋白水平的影响。结果1.用lapatinib处理乳腺癌细胞BT474和BT474/LR后,MTT比色分析结果显示BT474/LR细胞对抗lapatinib诱导的生长抑制。2.Western blot结果显示,BT474和BT474/LR细胞经lapatinib处理后,BT474/LR细胞对抗lapatinib诱导CIP2A下调。3.Western blot检测CIP2Ash RNA编码的慢病毒感染BT474/LR后的稳定克隆细胞株在CIP2A蛋白水平上的表达,CIP2A表达得到有效沉默。4.MTT结果提示,相对于BT474/LR中lapatinib所诱导的近乎忽略的增长抑制,CIP2A在BT474/LR细胞中沉默后,显著增强这些细胞对lapatinib的敏感性。5.ELISA分析lapatinib对BT474/LR和BT474/LR/si CIP2A细胞凋亡的结果提示,lapatinib对BT474/LR细胞的凋亡几乎没有影响;而CIP2A在BT474/LR细胞中沉默后,lapatinib对其凋亡作用明显增强。提示CIP2A沉默后,增强了BT474/LR对lapatinib诱导的凋亡活动。6.Lapatinib处理BT474/LR和BT474/LR/si CIP2A细胞后,Western blot分析结果显示,CIP2A在BT474/LR细胞中沉默后,lapatinib诱导的PARP和caspase-3的cleavage剪切片段都协同增加。7.CIP2A沉默后BT474/LR对lapatinib引起的p-Akt的抑制作用增强。提示CIP2A沉默后BT474/LR对lapatinib诱导的BT474/LR细胞的生长抑制和凋亡可能与其引起的p-Akt的抑制作用相关。结论CIP2A沉默增强BT474/LR细胞株对lapatinib的敏感性,也增加lapatinib诱导的生长抑制和凋亡活动,其诱导机制可能与CIP2A沉默后增加lapatinib对BT474/LR细胞中Akt活性的抑制相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

【参考文献】