二甲双胍抑制膀胱癌细胞并增强顺铂化疗敏感性及其机制的研究

发布时间：2018-05-01 00:37

  本文选题：膀胱癌 + 二甲双胍　； 参考：《重庆医科大学》2015年博士论文

【摘要】：第一部分二甲双胍对膀胱癌T24细胞迁移侵袭及增殖能力的影响目的：观察二甲双胍对迁移侵袭及增殖能力的影响。方法：用浓度分别为1、2、4、8 uM的二甲双胍在体外培养平板的单层细胞上进行划痕实验,作用细胞6h及12h后,于各时间节点采集图像检测细胞迁移能力变化；用浓度分别为1、2、4、8 uM的二甲双胍分别加入膀胱癌T24单细胞悬液的Transwell侵袭小室的上室,于6h和12h取出小室,利用侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化；通过MTT比色法,按空白组及1、2、4、8uM浓度的二甲双胍加药处理48h,分析细胞的增殖情况；通过MTT比色法,用空白组及4uM二甲双胍处理12h、24h、48h、72h,分析细胞的增殖情况。结果：迁移实验结果显示：6h及12h的划痕愈合率,二甲双胍各浓度组(1、2、4、8 uM)与空白组比较差异有统计学意义(P0.05)；而且二甲双胍各浓度组间比较差异也有统计学意义(P0.05)。体外侵袭实验结果显示：6h及12h的每个视野的细胞数,二甲双胍各浓度处理组(1、2、4、8 uM)与空白组比较,差异具有统计学意义(P0.05)；而且二甲双胍各浓度组间比较平均每个视野细胞数差异也有统计学意义MTT比色法结果显示：当二甲双胍以浓度1、2、4、8uM作用于细胞48h时,细胞活力与空白对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05)；4uM与1、2uM浓度组比较细胞活力差异具有统计学意义(P0.05),而对于4uM与8uM浓度组比较,两者细胞活力不具有统计学差异(P00.05)。同时,MTT结果显示：当4uM二甲双胍作用细胞48h组与作用12、24h细胞组及空白对照组对比,细胞活力之间的差别具有统计学意义(P0.05),而对于48h与72h组细胞活力来比较,其差异没有统计学意义(P0.05)。结论：二甲双胍不但能够减弱膀胱癌细胞株T24的迁移及侵袭能力,并且能够抑制膀胱癌细胞株T24的增殖,而上述这种抑制呈一定的浓度及时间依赖性。二甲双胍作用浓度在4uM、作用时间在48h时可以作为较适宜的体外实验的工作浓度及工作时间第二部分二甲双胍对膀胱癌T24细胞增殖凋亡侵袭相关调控基因表达的影响目的：观察二甲双胍对膀胱癌T24细胞增殖凋亡相关调控基因表达的影响。方法：在不同浓度(1、2、4、8 uM)的二甲双胍作用于膀胱癌T24细胞48h后进行以下检测。通过Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞仪(FCM)分析凋亡情况；使用Rt-PCR法分别检测T24细胞中增殖、凋亡相关调控基因cyclinD1、HIF-1、c-Myc、caspase8、caspase9,迁移、侵袭相关调控基因MMP-2、MMP-9的表达变化；Western blot检测细胞中增殖、凋亡相关调控蛋白cyclinD1、HIF-1、c-Myc、 caspase8、 caspase9及迁移、侵袭相关调控蛋白MMP-2、MMP-9的表达变化。结果：在特定工作时间(48h)下,当二甲双胍以不同浓度(1、2、4、8 uM)作用于膀胱癌细胞T24后以下的检测结果。Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞仪(FCM)显示：细胞的细胞凋亡率与空白对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05),而对于4uM与8uM浓度组比较,两者细胞凋亡率不具有统计学差异(P0.05)。Rt-PCR法结果显示：随着二甲双胍浓度的递增,cyclinD1、HIF-1、c-myc基因表达有逐渐降低的趋势,而caspase-8以及caspase-9基因表达随着药物浓度的增加而逐渐升高,除二甲双胍(1uM)浓度组之外,其余浓度组cyclinD1、 HIF-1、c-myc、caspase-8、caspase-9基因表达与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05),而对于二甲双胍(4uM)与二甲双胍(8uM)浓度组cyclinD1、HIF-1、c-myc、caspase-8、caspase-9基因表达变化差异不具有统计学意义(P0.05)；对于与细胞迁移及侵袭相关的MMP-2、及MMP-9基因表达变化并不明显(P0.05)。 Western blot检测结果显示：蛋白分子cyclinD1、HIF-1、c-Myc其表达随着二甲双胍的浓度增加逐渐降低,caspase-8、caspase-9蛋白表达却随着二甲双胍浓度增加逐渐升高,各蛋白表达与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05),而对于二甲双胍(4uM)与二甲双胍(8uM)浓度组cyclinD1、caspase-8、caspase-9基因表达变化差异不具有统计学意义(P＞0.05), MMP-2、MMP-9表达变化不明显,各组之间差异不具有统计学意义(P0.05)。结论：在特定时间(48h)作用后,二甲双胍能够以浓度梯度促进膀胱癌细胞株T24凋亡,抑制其增殖及凋亡调控相关蛋白cyclinD1、 HIF-1、c-Myc表达,促进蛋白caspase8以及caspase9表达上调,但并不影响其迁移及侵袭相关调控蛋白MMP-2、MMP-9的表达,这些变化可能与二甲双胍引起的膀胱癌细胞AMPK或mTOR信号通路变化有关。第三部分二甲双胍在体外增强膀胱癌细胞T24及BIU-87对顺铂敏感性及其机制的研究目的：研究二甲双胍在体外增强膀胱癌细胞T24及BIU-87对顺铂敏感性及其机制。方法：在体外MTT法初步检测不同浓度的(0.125、0.25、0.5、1.0 uM)的顺铂分别处理膀胱癌T24与BIU-87细胞48h后,检测顺铂单药对膀胱癌细胞增殖能力的抑制。采用不同浓度(1、2、4、8uM)二甲双胍联合顺铂(0.5uM)作用于膀胱癌T24与BIU-87细胞48h后,通过MTT实验分析细胞的增殖情况。选取顺铂(0.5 uM)、二甲双胍(4uM)、顺铂(0.5 uM)联合二甲双胍(4 uM)分别作用T24与BIU-87细胞48h后,流式细胞术对比其细胞周期变化；用Western blot法检测并观察AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白表达变化；细胞免疫荧光检测p-mTOR蛋白在各处理组细胞中的表达。结果：MTT法结果显示：当顺铂浓度分别高于或等于0.5 uM处理膀胱癌T24及BIU-87细胞株48 h,与空白组细胞及浓度低于0.5uM各处理组细胞相比,细胞活力明显降低,其差异具有统计学意义(P0.05),而对于两株细胞0.5uM及luM处理组比较,两者细胞活力差异不具有统计学意义(P0.05),选择0.5uM顺铂作为后续实验工作浓度。MTT结果显示：当不同浓度二甲双胍(1、2、4、8 uM)分别与顺铂(0.5 uM)联合作用处理膀胱癌T24及BIU-87细胞株48 h后,与空白组相比,细胞活力明显降低,其差异具有统计学意义(P0.05),对于两株细胞顺铂联合低浓度(1、2、4 uM)二甲双胍明显呈剂量依赖抑制细胞增殖,而对于顺铂联合高浓度(4、8 uM)二甲双胍作用细胞,细胞活力变化不具有统计学意义(P0.05)。流式细胞术显示：与对照组及顺铂(0.5 uM)、二甲双胍(4 uM)单药处理组相比,二甲双胍(4 uM)和顺铂(0.5 uM)联合用药处理组能够显著抑制膀胱癌T24及BIU-87细胞株于sub-G1期(p＜0.05)。Western blot结果显示：联合处理组膀胱癌T24与BIU一87细胞中p-mTOR蛋白与单药处理组及对照组比较表达明显减少,其差异具有统计学意义(P0.05),而AMPK、 p-AMPK、mTOR表达变化并不明显(P0.05)。细胞免疫荧光实验显示：膀胱癌T24、BIU-87细胞的空白组、二甲双胍处理组、顺铂处理组、二甲双胍与顺铂联合处理组免疫荧光阳性细胞数比较差异具有统计学意义(P0.05),顺铂+二甲双胍联合处理组阳性细胞数明显少于空白组及单药处理组(P0.05)。结论：体外实验显示中低浓度的二甲双胍能显著提高顺铂抑制膀胱癌细胞增殖的能力,其很可能与对信号通路mTOR的抑制有关。第四部分二甲双胍增强帻铂霄捣瞅癌细胞T24源性课鼠移植瘤生长及血管形成抑制能力的体内研究目的：体内实验研究一定浓度的二甲双胍联合顺铂对膀胱癌细胞T24源性移植瘤生长及血管形成能力的影响。方法：构建T24细胞裸鼠移植瘤模型,采用一定浓度的顺铂(2mg/ Kg/4d)与二甲双胍(250mg/Kg/4d)单独或联合用药后观察其移植瘤生长变化,免疫组织化学法检测移植瘤血清VEGF浓度及增殖指标Ki-67及微血管密度指标CD34变化。结果：裸鼠移植瘤的体内药物实验表明：二甲双胍(2mg/Kg/4d)联合顺铂(250mg/Kg/4d)对移植瘤的体积及重量的增加能够起到明显的抑制作用,其与单药处理组及对照组比较差异具有统计学意义(P0.05)；免疫组织化学结果显示：二甲双胍联合顺铂能够更明显减低裸鼠模型血清VEGF的浓度及移植瘤的Ki-67阳性细胞数及微血管密度(由CD34标识),其与对照组及单药处理组相比较,差异具有显著的统计学意义(P0.05)。结论：在裸鼠移植瘤的体内药物实验中,二甲双胍也能显著增强顺铂对移植瘤的生长抑制和血管形成。
[Abstract]:The effects of metformin on the invasion and proliferation of bladder cancer cells were studied . The effects of metformin on migration invasion and proliferation were studied .
The cells were taken out at 6 h and 12 h , and the invasion ability of cells was detected by invasive experiments .
The proliferation of cells was analyzed by MTT colorimetric method , and treated with metformin in blank group and 1 , 2 , 4 , 8 uM concentration for 48 hours .
The proliferation of cells was analyzed by MTT colorimetric method , treated with blank group and 4 uM metformin for 12 h , 24 h , 48 h and 72 h . Results : The results showed that the rate of scar healing at 6 h and 12 h and the difference of metformin concentration group ( 1 , 2 , 4 , 8 uM ) were significant ( P0.05 ) .
The results of the in vitro invasion experiment showed that the number of cells per field of view at 6 h and 12 h and the treatment group ( 1 , 2 , 4 , 8 uM ) of metformin were statistically significant ( P0.05 ) .
Compared with the blank control group , the cell viability was significantly higher than that of the blank control group ( P0.05 ) .
The effects of metformin on proliferation and invasion of bladder cancer cell line 24 were observed . The results showed that metformin not only decreased the migration and invasion ability of bladder cancer cell line 24 , but also inhibited the proliferation of bladder cancer cell line 24 . Conclusion : Metformin not only can decrease the proliferation of bladder cancer cell line 24 , but also can inhibit the proliferation of bladder cancer cell line 24 .
The expressions of cyclin D1 , HIF - 1 , c - Myc , caspase8 , caspase9 , migration and invasion - related genes of MMP - 2 and MMP - 9 were detected by Rt - PCR .
The expressions of cyclin D1 , HIF - 1 , c - myc , caspase8 , caspase - 9 and caspase - 9 in human bladder cancer cells were significantly higher than those in control group ( P0.05 ) .
The expression of MMP - 2 and MMP - 9 in MMP - 2 and MMP - 9 were not significant ( P0.05 ) . The expressions of cyclin D1 , caspase - 8 , and caspase - 9 in bladder cancer cell line 24 and BIU - 87 were detected by MTT assay .
Western blot was used to detect and observe the expression of AMPK , p - AMPK , mtor , p - mtor protein .
Results : Compared with control group , cisplatin ( 0.5 uM ) and cisplatin ( 0.5 uM ) , there was no significant difference between the two groups ( P0.05 ) . The results showed that compared with control group and cisplatin ( 0.5 uM ) group , there was no statistical significance ( P0.05 ) . The effects of metformin plus cisplatin on the growth and angiogenesis of bladder cancer cells were studied in vivo . The results showed that the volume and weight of transplanted tumor were significantly inhibited by the combination of metformin ( 2mg / Kg / 4d ) and metformin ( 250 mg / Kg / 4d ) .
The results showed that metformin combined with cisplatin can significantly reduce the serum VEGF concentration in nude mice and the Ki - 67 positive cell number and microvessel density ( identified by CD34 ) of transplanted tumor , which has significant statistical significance compared with the control group and the single - drug treatment group ( P0.05 ) . Conclusion : Metformin can significantly enhance the growth inhibition and angiogenesis of the transplanted tumor in nude mice .

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 宋小明,曹义福,蔡兴荣;加工废旧铁桶引起的急性硫酸二甲脂中毒[J];职业医学;1985年05期

2 陈洪兴;硫酸二甲脂中毒17例报告[J];辽宁医学杂志;1996年03期

3 王家治;巩固提高“二甲”医院成果的对策[J];厂矿医药卫生;1997年03期

4 张叔良;;Ⅸ-18标|dXW假漆的方法[J];药学文摘;1958年03期

5 黄平;降糖益肾方合二甲双瓜治疗2型糖尿病50例[J];浙江中医学院学报;2004年04期

6 余约军;;二甲牛地汤治疗重症血小板减少症二则[J];浙江中医杂志;2010年01期

7 米玉华;硫酸二甲脂引起广泛皮肤烧伤的护理[J];河南医科大学学报;1995年04期

8 夏旭光;尹峥;;7-二氟亚甲基-5,4’-二甲烷氧基异黄酮对高糖损伤的猴视网膜血管内皮细胞的保护作用[J];眼科新进展;2008年02期

9 石荣显，邓小群，，赵永林;二甲唑的合成[J];中国医药工业杂志;1994年08期

10 刘厚德;浅谈创建“二甲”妇保院的几点体会[J];江苏卫生事业管理;2005年01期

相关会议论文 前10条

1 郭勇;;抢救一例二甲硫酯中毒的体会[A];第十一次全国急诊医学学术会议暨中华医学会急诊医学分会成立二十周年庆典论文汇编[C];2006年

2 邱明琪;;关于二甲双胍降糖以外的疗效[A];江西省中西医结合学会内分泌专业委员会第二次学术会议、内分泌与代谢性疾病中西医结合诊治新进展学习班资料汇编[C];2013年

3 高晓东;胡必杰;崔扬文;孙伟;沈燕;;上海市二甲以上医院环境清洁消毒及监测现状调查[A];中华医学会第七次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2012年

4 郑骄阳;陆斌;邹俊杰;陈向芳;石勇铨;刘志民;;盐酸二甲双胍缓释片治疗2型糖尿病的疗效及安全性研究[A];2008内分泌代谢性疾病系列研讨会暨中青年英文论坛论文汇编[C];2008年

5 徐书杭;陈国芳;刘超;;二甲双胍的降糖外作用[A];5TH全国中西医结合内分泌代谢病学术大会暨糖尿病论坛论文集[C];2012年

6 张丹丹;沈莺;刘芳;;性激素对2型糖尿病患者体内二甲双胍代谢以及血乳酸的影响[A];中华医学会第十一次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2012年

7 赖晓阳;高慧;;左旋甲状腺素片联合二甲双胍对肥胖伴多囊卵巢综合征的疗效观察[A];中华医学会第二届糖尿病及性腺疾病学术会议论文集[C];2012年

8 王增;余勤;梁茂植;向瑾;南峰;秦永平;;HPLC-MS/MS法测定人血浆中二甲啡烷浓度[A];第十三次全国临床药理学学术大会论文汇编[C];2012年

9 徐晶晶;林金芳;;二甲双胍治疗青春期PCOS患者后各项胰岛素敏感性指标变化之比较[A];第七次全国妇科内分泌学术会议论文汇编[C];2013年

10 刘娟;张久星;田甜;;二甲双胍与硝苯地平合用致低血糖1例[A];2012年全国医院药学学术年会暨第72届世界药学大会卫星会论文集[C];2012年

相关重要报纸文章 前8条

1 苗瑞峰;全市实现县(市、区)级医院“二甲”全覆盖[N];忻州日报;2011年

2 张柏林;二甲双胍缓释剂效价比优势明显[N];中国医药报;2011年

3 宋明;德昌县人民医院 创“二甲”促医院发展[N];凉山日报(汉);2010年

4 周俊佳;省专家组对宁南县医院进行“二甲”等级评审[N];凉山日报(汉);2010年

5 本报记者 金鑫;我市“二甲”医院年内实现全覆盖[N];宝鸡日报;2011年

6 记者 张淑会;受援医院3年全“达”二甲[N];河北日报;2009年

7 本报通讯员 周东华 本报记者 王克勇;咬定青山不放松[N];台州日报;2006年

8 本报记者 白洁 通讯员 王耀宗;目标，在奋斗中实现[N];鄂尔多斯日报;2008年

相关博士学位论文 前4条

1 汪东;二甲双胍抑制膀胱癌细胞并增强顺铂化疗敏感性及其机制的研究[D];重庆医科大学;2015年

2 廖云飞;二甲双胍对2型糖尿病患者循环内皮祖细胞的影响及机制研究[D];华中科技大学;2009年

3 李央;PCOS胰岛素抵抗风险因子与二甲双胍治疗干预研究[D];复旦大学;2007年

4 龚燕平;二甲双胍在新诊断2型糖尿病患者中的应用[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年

相关硕士学位论文 前8条

1 耿飞飞;二甲双胍与胰岛素治疗妊娠期糖尿病的疗效及安全性系统评价[D];新疆医科大学;2015年

2 张桂春;二甲双胍的药代动力学研究[D];华东师范大学;2008年

3 任卓;二甲双胍对脂肪变性成肌细胞甘油三酯含量的影响[D];中国医科大学;2010年

4 黄志坚;二甲双胍缓释片和即释片对2型糖尿病疗效及安全性比较的系统评价[D];广西医科大学;2008年

5 陈丹玲;二甲双胍治疗初发2型糖尿病及糖耐量异常患者的疗效观察[D];山东大学;2009年

6 卫曼曼;二甲双胍激活腺苷酸活化蛋白激酶途径改善内皮功能的研究[D];郑州大学;2011年

7 赵峗;青春期多囊卵巢综合征患者临床、内分泌代谢特征的研究及二甲双胍治疗效果分析[D];复旦大学;2008年

8 韩睿;Metformin抑制IL-6/STAT3信号途径克服肺癌EGFR-TKI获得性耐药的作用和机制的研究[D];第三军医大学;2014年

本文编号：1826977