性染色体转录长链非编码RNA在肝癌性别差异中的功能及机制研究

发布时间：2018-05-02 04:18

本文选题：肝细胞肝癌 + 性别差异　；参考：《第二军医大学》2016年博士论文

【摘要】：原发性肝癌是全球范围内发病率最高的恶性肿瘤之一,尤其是包括我国在内的东亚地区。尽管目前已有多种治疗手段,肝癌致死率仍然很高,在男性肿瘤相关死亡中高居第二位,在女性肿瘤相关死亡中也排在第六位。原发性肝癌80%以上属于肝细胞肝癌,肝癌的主要危险因素包括肝炎病毒感染、化学致癌因子、酒精性及非酒精性肝硬化、二型糖尿病及吸烟等。肝癌的另一特征是男女发病率存在差异,男性肝癌发病率明显高于女性。长期以来,针对肝癌性别差异现象的研究证明了性激素通路及炎性因子等在其中的重要作用,然而肝癌激素治疗和去势治疗并没有取得理想的治疗效果,反而产生较大的副作用。因此,肝癌发生的性别差异机制仍有待于进一步研究。遗传物质的角度,男女之间最大的差异是性染色体的区别(XXXY),然而性染色体编码基因的研究亦未能解释肝癌的性别差异现象。长链非编码RNA是近期的研究热点,是长度超过200nt的不具备蛋白编码能力的转录本,以RNA形式参与了多种生理及病理过程。本研究中,我们关注性染色体转录的长链非编码RNA与肝癌发生及性别的关系和作用机制。女性体细胞两条X染色体中一条发生失活,以平衡不同性别之间的基因剂量,称为X染色体失活(X chromosome inactivation,XCI)。然而,近期研究发现一些位于X染色体失活中心的基因发生逃逸现象,在失活的染色体上仍有表达,这将重新导致男女基因表达失衡,在女性器官中高水平表达。女性肝脏中是否存在失活逃逸,逃逸基因是否能够在女性肝脏中发挥保护作用,抵抗肝癌发生。Y染色体是男性特有的染色体,尤其是男性特异性区(male specific region of the Y-chromosome,MSY),编码男性特异性基因。Y染色体特异性基因在男性肝癌中是否有特异性的激活,是否与男性肝癌高发有关。针对以上科学问题,我们设计本研究,探索性染色体非编码转录本在肝癌性别差异形成中的功能。通过对逃逸基因的筛选,我们发现长链非编码RNA FTX(lnc-FTX)在女性肝组织中的表达高于男性。lnc-FTX在肝癌中被下调,肝癌组织中lnc-FTX的表达水平与肝癌病人预后相关,高水平的lnc-FTX预示病人预后较好,术后生存期较低表达组更长。体外细胞实验证实,lnc-FTX能够抑制肝癌细胞增殖和转移。裸鼠体内实验证实,lnc-FTX能够抑制肝癌细胞体内成瘤。lnc-FTX干扰的QSG7701细胞系裸鼠皮下荷瘤实验说明,干扰lnc-FTX能够促进肝细胞系皮下成瘤,促进恶性转化。RNA pull-down和RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)实验证明,lnc-FTX结合MCM2蛋白,阻碍MCM2蛋白结合染色体组装DNA复制复合物的过程,导致DNA复制阻滞,从而抑制肝癌细胞的增殖。lnc-FTX还通过序列互补方式结合吸附mi R-374a,RNA pull-down实验和MS2-RIP实验证明lnc-FTX与mi R-374a的直接结合。双荧光素酶报告系统证实lnc-FTX是mi R-374a的靶基因。RT-PCR实验和蛋白免疫印迹实验证明,lnc-FTX能够上调mi R-374a的靶基因Wnt5A、WIF1和PTEN,而且对三者的调控作用通过mi R-374a实现。Wnt5A、WIF1和PTEN是Wnt/β-Cantenin信号通路负向调控因子,lnc-FTX能够通过上调三者表达而抑制Wnt/β-Cantenin信号通路活性,这一抑制作用由β-Cantenin报告系统TOP/FOPflash活性和Wnt通路活化基因表达水平证实。lnc-FTX抑制Wnt/β-Cantenin信号通路活性,抑制肝癌细胞上皮-间质转化(EMT)过程,降低了肝癌转移和侵袭的能力。RNA原位杂交和蛋白免疫荧光实验证实,lnc-FTX在胞核中与MCM2蛋白结合,在胞浆中则能够结合mi R-374a,从而同时发挥抑制增殖和抑制转移的功能。lnc-FTX对肝癌的性别差异影响体现在它对女性的保护作用。肝癌发生前,女性肝组织中高水平的lnc-FTX通过结合并抑制MCM2,影响DNA复制复合物的组装,导致DNA复制和细胞增殖阻滞,从而抑制肝细胞异常增生,防止肝细胞的恶性转化。肝癌发生后,女性高水平的lnc-FTX结合吸附mi R-374a,减少游离mi R-374a,抑制Wnt/β-Cantenin信号通路和肝癌EMT过程,减少肝癌侵袭和转移,从而减缓肝癌进展。我们比较Y染色体转录本在男性肝癌组织和癌旁组织的表达差异发现,长链非编码RNA RBMY2FP(RNA binding motif protein,Y-linked,family 2,member F pseudogene,lnc-RBMY2FP)是差异最明显的转录本。进一步通过PCR检测发现,lnc-RBMY2FP仅在约1/3男性肝癌组织中特异性的活化表达,癌旁组织和女性组织中均无表达。我们还检测了肺癌、结肠癌、胰腺癌和食管癌等组织,lnc-RBMY2FP均呈阴性。lnc-RBMY2FP阳性表达病人预后结果更差,术后生存期明显短于阴性病人。体外实验和裸鼠体内实验证明,lnc-RBMY2FP能够促进肝癌细胞增殖和成瘤。亚硫酸氢盐甲基化测序法发现,阳性肝癌组织中RBMY2FP基因启动子区Cp G甲基化程度明显降低,lnc-RBMY2FP的活化与启动子区去甲基化有关。RNA pull-down和RIP实验证明lnc-RBMY2FP能够结合DNA甲基转移酶1(DNMT1)。染色质免疫共沉淀实验(chromatin immunoprecipitation,CHIP)证实,lnc-RBMY2FP抑制DNMT1与RBMY基因簇启动子区的结合,导致该区域发生去甲基维持障碍,发生异常的低甲基化,激活RBMY1A1基因表达,促进肿瘤的增殖和生长。综上所述,我们对肝癌性别差异进行了深入研究,发现性染色体编码的非编码RNA在肝癌发生和发展中的重要作用,发现了与女性肝癌抵抗相关的抑制因子lncFTX和男性肝癌特异性的促癌因子lnc-RBMY2FP,有助于肝癌性别差异的解释,并且为肝癌预防和治疗提供潜在的靶点。
[Abstract]:Primary liver cancer is one of the most common malignant tumors in the world , especially in the East Asia region , including our country . Although there are many kinds of treatment methods , the death rate of liver cancer is still very high . The main risk factors of liver cancer include hepatitis virus infection , chemical carcinogen factor , alcoholic and non - alcoholic cirrhosis , type 2 diabetes and smoking . In vivo experiments , we found that lnc - FTX can inhibit the proliferation and metastasis of liver cancer cells . In vivo experiments prove that lnc - FTX can inhibit the proliferation and metastasis of liver cancer cells . In vivo experiments prove that lnc - FTX can inhibit the proliferation and metastasis of liver cancer cells . In vitro and in vivo experiments prove that lnc - RBMY2FP can inhibit the proliferation and proliferation of hepatocellular carcinoma . In vitro and in vivo experiments prove that lnc - RBMY2FP can bind to DNA methyltransferase 1 ( DNMT2 ) . In vitro and in vivo experiments prove that lnc - RBMY2FP can bind to DNA methyltransferase 1 ( DNMT2 ) . In conclusion , we find that lnc - RBMY2FP can bind to DNA methylase 1 ( DNMT2 ) . and provides a potential target for the prevention and treatment of liver cancer .

【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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