化合物BENC-511抑制非小细胞肺癌侵袭转移的作用研究

发布时间：2018-05-02 10:53

本文选题：非小细胞肺癌 + 侵袭转移　；参考：《山东大学》2016年硕士论文

【摘要】：肺癌尤其是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)具有高发病率、高转移性、易复发和易耐药等特性,已成为全球范围内致死性最高的癌症。绝大多数患者会发生转移,而且约30%的手术切除后患者发生复发甚至死亡,所以针对非小细胞肺癌的预防转移治疗及药物研发成为亟待解决的难题。研究表明超过60%的非小细胞肺癌患者癌细胞过表达EGFR,而使用酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)是最佳治疗方案,然而至今仍没有药物能有效提高总存活率。其中最大的挑战是过表达受体酪氨酸激酶(RTK)的癌细胞会通过PI3K信号通路抵抗TKIs的作用。大量研究表明PI3K/Ak t信号网络在NSCLC诱发及转移中具有重要作用。许多NSCLC早期患者的原发癌组织和转移前沿中发现有PIK3CA基因的扩增、PI3K蛋白的高表达以及信号通路下游因子Akt、mTOR、PTEN的异常表达,靶向该信号通路中关键酶的抗癌药物开发已成为肿瘤预防和治疗的突破点。目前,虽已有PI3K通路抑制剂进入临床应用于部分患者,但针对这一通路的靶向小分子抑制剂的开发依旧是药物研发领域的热点。小分子化合物S14161 (8-乙氧基-2-(4-氟苯基)-3-硝基-2氢-苯并吡喃)是3-硝基苯并吡喃类外消旋化合物,是一种PI3K抑制剂,但由于其手性结构和较差的溶解性能抑制了其进一步的应用。为获得活性更优的化合物,我院药化研究所刘兆鹏教授对S14161的结构进行了简化,去除2位的4-氟苯基,发现了活性更好的3-硝基-2H-苯并吡喃类抗肿瘤衍生物BENC-511(6-溴-8-乙氧基-3-硝基-2氢-苯并吡喃)。前期实验显示BENC-511主要作用于PI3K/Akt通路,能显著抑制肿瘤细胞中Akt的磷酸化程度及下游信号蛋白的表达,具有良好的抗白血病和多发性骨髓瘤活性和较低毒性,但对非小细胞肺癌侵袭转移的作用未见报道。本课题主要从体外及体内水平考察BENC-511在抑制非小细胞肺癌侵袭转移方面的作用,并进一步通过检测PI3K相关信号通路蛋白的表达以及蛋白间相互作用阐明其作用机制。通过考察该化合物在抑制肺癌转移方面的作用,进一步完善其抗肿瘤活性研究,并为寻找新的作用靶点、研发新型抗肺癌转移药物提供理论依据。实验方法及结果体外试验：应用人非小细胞肺癌细胞株A549和人脐静脉内皮细胞株HUVEC,采用划痕试验观察化合物BENC-511(5和10μmol/L) 和S14161对细胞迁移的抑制作用；用Transwell小室试验检测BENC-511(10、5、2.5、1.25μmol/L)和S14161 (10μmol/L)对A549细胞侵袭的抑制作用。结果显示,BENC-511可抑制HUVEC细胞迁移能力；可抑制A549细胞迁移及侵袭能力。体内试验：采用C57BL/6J、鼠尾静脉注射B16BL6黑色素瘤细胞从而构建癌细胞实验性肺转移模型,持续灌胃给药BENC-511(20和40mg/kg)两周,取小鼠双肺,计数黑色转移瘤结节；采用A549-luc-GFP细胞在裸鼠体内构建实验性肺转移模型,连续灌胃给药2周,期间在第10天及14天用生物发光小动物活体成像仪观察瘤体积变化及转移情况。另外采用裸鼠移植瘤试验,小鼠腋下接种A549-luc-GFP细胞构建小鼠荷瘤模型,连续给药20天观察BENC-511对肿瘤生长的抑制情况。结果显示,BENC-511可抑制B16B L6及A549细胞实验性肺转移,且抑制A549细胞裸鼠移植瘤的生长。为研究BENC-511抑制肺癌细胞侵袭转移的作用机制,采用琼脂糖凝胶酶谱检测化合物BENC-511对A549细胞培养液中的基质金属蛋白酶(MMP-2. MMP-9)活性的影响；并用Western Blotting检测两种酶及相关信号通路蛋白表达。结果显示,BENC-511可抑制MMP-9的酶活性及蛋白表达,降低PI3K, Akt、 mTOR及其磷酸化形式蛋白表达,降低磷酸化EGFR蛋白表达,升高GSK3P表达从而降低细胞核内、外β-catenin表达量以及其靶基因ZEB1的转录。为进一步探讨化合物BENC-511抑制肺癌细胞侵袭转移的作用机制是否与ZEB1相关,使用划痕试验检测到H460、A549、H1299三种NSCLC细胞具有不同的侵袭特性,呈递增趋势。BENC-511对H1299细胞中ZEB1蛋白表达抑制率最高,且作用72h后的IC50值最低。随后,使用shRNA干扰细胞中ZEB1表达,发现细胞中的MMP-9、VEGF、β-catenin表达降低,E-cadherin、PTEN、P53表达增高,且BENC-511对细胞增殖及侵袭的抑制率提高。结论化合物BENC-511能抑制鼠黑色素瘤B16BL6细胞及肺癌A549细胞体内、外侵袭转移；其作用主要是通过直接抑制EGFR磷酸化,以及抑制PI3K/mTOR/β-catenin信号通路从而下调MMP-9实现的。BENC-511对非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭转移能力的抑制与ZEB1、β-catenin表达高低相关；shRNA降低ZEB1表达后可提高BENC-511对A549细胞活力和侵袭能力的抑制效果。
[Abstract]:Non - small cell lung cancer ( NSCLC ) , especially non - small cell lung cancer ( NSCLC ) , has the characteristics of high morbidity , high metastatic ability , easy recurrence and drug resistance , and has become the most fatal cancer in the world .
The inhibitory effect of BENC - 511 ( 10 , 5 , 2.5 , 1.25 渭mol / L ) and S14161 ( 10 渭mol / L ) on the invasion of A549 cells was investigated by Transwell chamber assay .
In vivo experiment : B16BL6 melanoma cells were injected intravenously with C57BL / 6 J mice , and B16BL6 melanoma cells were injected intravenously to construct the experimental lung metastasis model of cancer cells . Two weeks after administration of BENC - 511 ( 20 and 40mg / kg ) , mice were given double lung and counted the nodules of black metastatic tumor ;
The experimental lung metastasis model was constructed in nude mice by A549 - luc - GFP cells . The tumor volume changes and metastasis were observed in vivo on the 10th day and the 14th day . The results showed that BENC - 511 inhibited the experimental lung metastasis of B16B L6 and A549 cells and inhibited the growth of tumor growth in A549 cells . The results showed that BENC - 511 inhibited the growth of B16B L6 and A549 cells . MMP - 9 activity ;
The results showed that BENC - 511 inhibited the expression of MMP - 9 , reduced its expression , decreased the expression of phosphorylated EGFR protein , increased the expression of phosphorylated EGFR protein , increased the expression of extracellular 尾 - catenin and the transcription of its target gene . The results showed that the expression of MMP - 9 , VEGF , 尾 - catenin in the cells decreased , E - cadherin , PTEN and P53 increased , and BENC - 511 inhibited the proliferation and invasion of human lung cancer cells .
The effect of BENC - 511 on the proliferation and invasion and metastasis of non - small cell lung cancer cells is related to the expression of zeB1 and 尾 - catenin .
The inhibitory effect of BENC - 511 on the viability and invasion ability of A549 cells can be improved after the shRNA has been reduced by the shRNA .

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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