急性红白血病的基因组学研究

发布时间：2018-05-03 01:37

本文选题：急性红白血病 + 核型异常　；参考：《苏州大学》2015年博士论文

【摘要】：一、急性红白血病的临床和实验室特征的研究目的系统分析自2003年至2014年在本院诊治的160例急性红白血病(AEL)患者的临床及实验室特点,对比国内外报道,揭示本中心AEL患者的特点,并补充完善国际急性红白血病在细胞遗传学和分子生物方面的研究。方法 1.回顾性分析160例AEL的临床及实验室特点,其中143例AEL、40例MDS-E、46例MDS患者的骨髓细胞均采用直接或短期培养法制备染色体,用热变性R显带技术进行核型分析并分别按照IPSS和UKMRC标准对这些病例进行危险度分层;其中158例AEL患者按照2008 WHO诊断标准重新分型,并对入组的病例进行随访,按核型特点等分组进行生存分析。2.随机选取有初诊、缓解期DNA样本的6对AEL患者进行全外显子测序,60例初诊AEL的DNA样本进行Ion torrent检测,结合PCR扩增、桑格测序测序法共同检测验证基因突变,并随机选取7例初诊AEL的RNA样本进行基因表达谱芯片检测,分析总结AEL患者分子生物学特征。结果 1.按照2001版WHO分型标准,160例AEL患者中M6a 148例(占92.5%),M6b 12例(占7.5%)。男性92例,女性68例,男/女比例为1.35:1,中位发病年龄50岁(13-83岁),白细胞计数(white blood cell count,WBC)中位值为2.7×109/ml(0.52-182×109/ml),血红蛋白(hemoglobin,Hb)中位值为74g/L(36-148g/L),血小板(platelet,PLT)计数中位值为37×109/ml(4-715×109/ml),骨髓红系前体细胞百分比中位值60%(50%-97.5%),骨髓原始细胞占有核细胞比例中位值16%(0.5%-43.5%),骨髓原始细胞占非红细胞百分比中位值40%(20%-93.5%)。M6a和M6b两种亚型临床表现及外周血象相似,均可累及三系,仅骨髓中红系比例不同。160例AEL病例中共有143例可以进行核型分析。正常核型86例,占60.1%,异常核型57例,占39.9%,其中复杂核型(累及3条及3条以上染色体的异常核型)28例,占AEL的19.6%,占异常核型的49.1%。M6a和M6b两者的核型分布亦相似,均以正常核型为主,该点与国外报道不一致,可能与人种和地域性差异有关。2.158例AEL按照2008 WHO诊断标准重新分型,N-AEL 108例,AML-MRC 13例,MDS-AEL 37例。为进行同期比较,另有40例骨髓红系前体细胞≥50%的骨髓异常综合征(MDS-E)、46例骨髓红系前体细胞50%的骨髓异常综合征患者(MDS)也入组研究,比较各组间的临床及实验室特征。各组发病性别分布均为男性多于女性,血细胞降低可累及三系,N-AEL、AML-MRC、MDS-AEL、MDS发病年龄较MDS-E年轻,N-AEL外周血象仅血小板较MDS-E低,且P0.05,其他各组间外周血象无明显差异。N-AEL和MDS-E均以正常核型为主,AML-MRC、MDS-AEL及MDS则以异常核型为主,N-AEL与MDS-AEL间、MDS-E与MDS间核型分布有显著性差异。3.6对AEL病例初诊、缓解期样本分别进行全外显子测序,发现多种再现性基因突变,其中GATA2突变2处(33.3%)、CEBPA突变4处(66.7%),为进一步了解AEL突变情况,本研究对41例AEL患者进行Ion torrent方法检测AML常见的突变基因,69例AEL患者进行PCR扩增及桑格测序法检测GATA2和CEBPA突变,最终发现GATA2突变13例(18.8%),CEBPA突变33例(47.8%),RUNX1突变(4.9%)、NPM1突变(2.4%)、TET2突变(4.9%)、U2AF1突变(9.8%)、SETBP1(14.6%)等。4.结合患者临床信息、核型特征、突变信息,对AEL患者进行不同的分组,比较其预后差异。71例AEL患者按不同的治疗方式分为造血干细胞移植组和常规化疗组,造血干细胞移植组预后明显优于常规化疗组(P0.05)。根据核型分组,正常核型组中位生存期长于非复杂核型组,非复杂核型组预后优于复杂核型组,三者之间比较具有统计学差异(P0.05)。按照IPSS分组,中危组预后较高危组预后好,低危组预后较中危组预后好,且三组间均具有统计学差异。将MDS-E、AML-MRC、N-AEL、MDS-AEL及MDS五组预后进行比较,MDS预后较前四者好,其总生存期明显长于MDS-E、AML-MRC、N-AEL及MDS-AEL,P0.05。根据突变类型对AML进行分组,本研究中CEBPA突变及GATA2突变对患者预后均未见明显影响。5.7例AEL患者表达谱数据与网络GEO数据库中5例正常人CD34+细胞芯片数据及10例None-AEL数据分别进行比较分析,AEL表达谱与正常CD34+细胞的表达谱及None-AEL病例表达谱明显不同。结论:1.本组AEL病例与西方AEL患者临床特点相似,但本组病例有不同的细胞遗传学特点,本研究AEL人群核型分布以正常核型为主,且核型风险的升高与预后不良密切相关。2.本组AEL病例有独特的分子生物学特征。GATA2和CEBPA突变在AEL人群中频发,其他AML常见基因突变在AEL中散在分布。3.本组AEL病例具有独特的基因表达谱。二、GATA2相关基因的克隆、真核表达载体的构建及功能研究目的 1.克隆并构建GATA2突变体P304H、L321P、R330X及GATA2野生型真核表达载体。2.对GATA2各突变体进行初步的功能研究,以探索急性红白血病的发病机制。方法 1.通过定点诱变的方法,以PFLAG-GATA2质粒为模板,采用GATA2基因定点诱变特异性引物分别诱变出PFLAG-GATA2-P304H、PFLAG-GATA2-L321P、PFLAG-GATA2-R330X质粒;继而以这些质粒为模板,扩增出GATA2各突变体及野生型的基因编码区,并与慢病毒载体LV5连接,构建携带GATA2各相关基因的真核表达载体。所构建的全部克隆均送测序鉴定。2.慢病毒包装并侵染32D及NIH3T3细胞系,构建携带GATA2各突变体及野生型的稳转细胞株,western blot验证目的蛋白的表达。3.采用免疫荧光的方法观察NIH3T3稳转细胞株中野生型GATA2及其各突变体在细胞中的亚定位。4.以32D稳转细胞株为研究对象,绘制生长曲线、集落培养,明确GATA2突变对细胞增殖的影响。5.对32D各稳转细胞株进行瑞氏染色及TMB联苯胺染色,并以Ter119流式抗体检测细胞表面标志变化,RQ-PCR方法检测红系分化相关分子β-globin、βh1-globin的表达水平。6.以293T为细胞模型,采用荧光素酶报告基因检测的方法,检测GATA2各突变体转录活性的变化。7.抽提32D-GATA2-vector、32D-GATA2-P304H、32D-GATA2-L321P、32D-GATA2-R330X、32D-GATA2-wt的RNA样本,并进行基因表达谱芯片检测,比较GATA2突变和野生型及空载体组的差异,探索GATA2突变在急性红白血病发病中的作用。结果 1.免疫荧光结果显示GATA2蛋白野生型定位于细胞核;P304H、L321P及野生型GATA2蛋白亚细胞定位均位于细胞核,GATA2-R330X目的蛋白胞浆内质网与胞核内均有高表达。2.稳定表达GATA2各突变体及野生型的32D细胞,各组间增殖速度无明显差异。携带GATA2各突变体及野生型的32D细胞均能在软琼脂上呈克隆性生长,但各组间集落形成能力亦无明显差异。3.携带GATA2各突变体及野生型的32D细胞进行瑞氏染色,各组间形态上差异不明显,但联苯胺染色结果显示过表达GATA2各突变体可使联苯胺染色阳性细胞数目增加,以R330X最为明显。4.32D各突变体稳转细胞株细胞的Ter119表达增加,且与空载体组有显著性差异。5.32D各突变体稳转细胞株的β-globin、βh1-globin的表达水平均曾上升趋势。6.GATA2各突变体的转录活性较GATA2野生型明显降低,且当各突变体与一定剂量的GATA2野生型质粒共转染时,R330X组转录活性仍低于野生型组,且P0.05。7.GATA2各突变体的表达谱与GATA2野生型组不同,GATA2突变会导致细胞表达谱的改变。结论 1.GATA2突变可促进细胞向红系分化,并导致32D细胞表达谱改变。2.R330X可导致GATA2蛋白亚细胞定位改变。
[Abstract]:The clinical and laboratory characteristics of the patients with acute erythroleukemia were analyzed by direct or short - term culture method . The results showed that there were no significant differences between the two groups . The results showed that there were 13 cases of abnormal karyotype ( 47.8 % ) , 33 cases ( 47.8 % ) of patients with acute myeloid leukemia ( AML - MRC ) , 13 cases of AML - MRC and 37 cases of MDS . The expression profiles of GATA2 and the wild type of GATA2 were studied . The results showed that the expression profiles of GATA2 and CEBPA were similar to those of normal CD34 + cells . 3 . The expression profiles of GATA2 mutants and wild type GATA2 were significantly lower than those in wild type group .

【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71

【参考文献】