rApoptin对MCF-7乳腺癌细胞及其干细胞抑制作用的研究

发布时间：2018-05-04 00:16

本文选题：rApoptin + MCF-7人乳腺癌细胞　；参考：《大连医科大学》2016年博士论文

【摘要】：乳腺癌是女性群体最常罹患的恶性肿瘤,无论发病率还是致死率都位居环球妇女恶性肿瘤的第1位,且相应统计数字仍在持续上升。与增长迅猛的乳腺癌发病率相比,乳腺癌的治疗目前仍是世界性难题。因此,研发更有效的的抗肿瘤制剂,不仅具有极大的社会效益,还会产生巨大的经济效益。Apoptin是鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)唯一的功能性蛋白。与现有的抗肿瘤制剂相比,Apoptin具备以下几个特性:其一,Apoptin并不依靠P53途径促使肿瘤细胞发生凋亡,可有效治疗那些P53基因发生突变的肿瘤;其二,Bcl-2的过表达并不能抑制Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的效应,反而可被利用来增强其作用;其三,Apoptin具备选择性的诱导肿瘤细胞凋亡的能力。目前,若将Apoptin投入规模化生产和广泛临床应用,存在两个重要的技术瓶颈:其一,人体细胞膜表面没有Apoptin蛋白相关的受体,其不能与人的细胞结合、发挥效应;其二,原核表达的Apoptin蛋白在体外难以溶解、不能稳定保存,很难获得大量高纯度的制剂。为寻找并验证更好的应用Apoptin的技术手段,本课题组应用重组肿瘤特异性凋亡因子(r Apoptin),研究其对MCF-7人乳腺癌细胞及其干细胞在体内外的杀伤作用及机制。r Apoptin系GST-Apoptin经叶酸化学修饰而成的重组蛋白。研究发现,肿瘤细胞表面的叶酸受体数量是正常细胞的几十倍之多,这意味着叶酸修饰的r Apoptin蛋白可明显富集于肿瘤细胞、发挥杀伤作用。目前,尚无关于r Apoptin是否可有效抑制乳腺癌、乳腺癌干细胞及其相关作用机制的文献报道。因此,研究r Apoptin的杀伤效能及其相关作用机制,极有可能为提升乳腺癌临床疗效及预后结果带来新的希望。相关因子的磷酸化是Apoptin诱导细胞凋亡过程中重要的作用机制。Akt是其信号通路上游的核心因子,Apoptin进入胞浆后可磷酸化Akt并与之结合、将其“劫持”到胞核内,发挥诱发凋亡的作用。相对应的,Nur77的磷酸化则是信号通路下游的核心事件,Nur77被Apoptin磷酸化后从细胞核易位至胞浆,启动线粒体凋亡通路、推动凋亡进展。Caspase-3则是Apoptin信号通路的最终执行子,其通过被剪切活化来最终实现凋亡效应。本研究首先以MCF-7人乳腺癌细胞为试验对象。通过CCK-8法检测r Apoptin对MCF-7细胞的抑制率曲线,确定后续药物处理时间及浓度梯度;通过集落形成实验,测试r Apoptin的抑增殖效应;通过AV/PI双染法,测试其诱发凋亡的效能;通过Western Blot技术,检测加药处理后,Apoptin信号通路中,磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化Nur77(p-Nur77)及Caspase-3 p17活化片段的水平变化。在此基础上,我们建立了MCF-7细胞的裸鼠移植瘤模型,并以之为第二阶段的实验对象。荷瘤小鼠经r Apoptin治疗后,我们通过称量瘤体重量、HE染色来研究移植瘤的形态变化;通过免疫组化染色、Western Blot试验,观察移植瘤组织中Apoptin信号通路的激活情况。最后,我们以MCF-7细胞中的乳腺癌干细胞为实验对象。通过乳腺癌干细胞标记CD44+/CD24-的流式细胞分析、无血清培养乳腺球形成实验及Western Blot、q RT-PCR技术,检测ALDH1的水平变化,以明确r Apoptin是否可有效抑制MCF-7细胞中的乳腺癌干细胞。第一部分r Apoptin对MCF-7人乳腺癌细胞生长抑制作用的研究目的:探讨r Apoptin是否可有效抑制MCF-7细胞的生长、诱发凋亡及其相关作用机制,为进一步研究r Apoptin的体内作用奠定基础。方法:以CCK-8法检测r Apoptin对MCF-7细胞的生长抑制率曲线,以细胞集落形成实验测试其抑增殖效应,Annexin V/PI双染法检测其诱发凋亡的效能,Western Blot检测r Apoptin加药处理对Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3活化水平的影响。结果:r Apoptin可抑制MCF-7细胞的生长、诱导其凋亡;其作用机制是经由Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3的激活来实现的。CCK-8实验结果显示:r Apoptin处理24h,其IC50为3.2μg/ml;当药物浓度为1.0μg/ml、2.0μg/ml、3.0μg/ml、3.5μg/ml、4.0μg/ml、5.0μg/ml、6.0μg/ml、7.0μg/ml时,MCF-7细胞的生长抑制率逐渐升高,依次为6.67±1.10%、38.13±2.48%、45.09±3.60%、56.30±4.59%、68.79±6.08%、85.59±4.36%、92.34±1.00%、94.56±0.99%;除6.0μg/ml、7.0μg/ml组间外,其余各组间生长抑制率均有统计学差别(P0.05)。集落形成实验结果显示:加药6天,当药物浓度为0μg/ml、0.6μg/ml、1.2μg/ml、1.8μg/ml、2.4μg/ml、3.0μg/ml时,各组的克隆形成率逐渐降低,依次为93.67±1.86%、85.56±1.90%、42.56±6.08%、27.22±4.68%、14.56±3.86%、8.67±1.33%;各实验组的克隆形成率与对照组相比均有显著差别(P0.01);除2.4μg/ml、3.0μg/ml组间外,其余各实验组间均有统计学差别(P0.05)。流式细胞Annexin V/PI双染法显示:加药24h,0μg/ml、1.6μg/ml、3.2μg/ml、4.8μg/ml组的早期细胞凋亡率逐渐升高,依次为1.36±0.14%、4.24±0.74%、4.69±0.60%、12.84±1.24%,1.6μg/ml、3.2μg/ml组间无显著差别(P0.05),其余组间有统计学差别(P0.05);同时,各组晚期凋亡和坏死率依次为0.78±0.42%、2.00±0.52%、1.93±0.76%、2.30±0.79%,组间无统计学差别(P0.05)。Western Blot检测结果显示:加药24h,MCF-7细胞中p-Akt、p-Nur77及Caspase-3 p17的水平随药物浓度增加而逐渐升高,组间比较有统计学差别(p0.05)。结论:r Apoptin可抑制MCF-7细胞的生长、诱导其发生凋亡,药物浓度与凋亡效应之间存在正向的剂量与效应关系。r Apoptin可致Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3的激活,其诱发凋亡的机制可能是通过Apoptin的凋亡诱导信号通路来实现的。除诱发凋亡的作用外,r Apoptin可能具备对MCF-7细胞的细胞周期抑制能力。第二部分r Apoptin对MCF-7人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用目的:探讨r Apoptin是否能够有效的抑制MCF-7细胞裸鼠移植瘤生长、诱导凋亡及其相关作用机制。方法:通过在裸鼠乳腺垫内注射MCF-7细胞种植移植瘤。使用r Apoptin治疗后,通过测量瘤体重量、HE染色观察移植瘤的形态变化;通过免疫组织化学染色、Western Blot技术检测移植瘤组织中p-Akt、p-Nur77及Caspase-3 p17活化片段的水平变化。结果:r Apoptin可抑制MCF-7细胞裸鼠移植瘤的生长、诱发凋亡;其作用机制是经由Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3的激活来实现的。移植瘤测量结果显示:经r Apoptin注射,0mg/kg、0.8mg/kg、1.6 mg/kg组肿瘤的重量逐渐降低,依次为2.50±0.27g、1.92±0.60g、1.18±0.29g,各组间均具有统计学差别(p0.05)。HE染色结果显示:加药组多见片灶状组织结构缺失,多数细胞体积缩小,细胞核固缩深染,未见明显炎症反应。免疫组化染色结果显示:各实验组肿瘤细胞中,p-Akt、p-Nur77和Caspase-3 p17均被染成棕黄色、定位于胞浆中,随药物浓度增加、其含量逐渐升高。Western Blot检测结果显示:加药24h,移植瘤组织中p-Akt、p-Nur77及Caspase-3 p17的水平随药物浓度增加而逐渐升高,组间比较具有统计学差别(p0.05);Western Blot的检测结果与免疫组化染色结果基本一致。结论:r Apoptin可抑制MCF-7细胞裸鼠移植瘤的生长、诱导其凋亡,药物浓度与凋亡效应之间存在正向的剂量与效应关系。r Apoptin诱发凋亡的作用机制是通过Apoptin凋亡信号通路,经由Akt、Nur77的磷酸化及Caspase-3的激活来实现的。r Apoptin可有效穿过MCF-7细胞的细胞膜及核膜,且叶酸修饰并不影响其Apoptin部分的诱发凋亡能力。r Apoptin对荷瘤的裸鼠无明显毒副作用。第三部分r Apoptin对MCF-7细胞中的乳腺癌干细胞抑制能力的研究目的:探讨r Apoptin是否能够有效的抑制MCF-7细胞中的乳腺癌干细胞方法:通过CD44+/CD24-流式细胞比例分析、无血清培养乳腺球形成实验及Western Blot、q RT-PCR技术检测ALDH1的水平,来检验r Apoptin是否可对MCF-7细胞中的乳腺癌干细胞产生有效抑制。结果:r Apoptin对MCF-7细胞中的乳腺癌干细胞无显著抑制作用。流式细胞仪检测结果显示:加药24h,0μg/ml、1.6μg/ml、3.2μg/ml、4.8μg/ml组CD44+/CD24-细胞的比例逐渐升高,依次为2.10±0.16%、7.61±1.11%、10.38±0.97%、13.21±1.90%,各组间均具有统计学差别(p0.05)。乳腺球形成实验结果显示:加药处理14d,0μg/ml、1.2μg/ml、2.4μg/ml组形成的乳腺球均细胞连接紧密、体积大小无显著差别,其数量依次为116.33±5.03、122.33±4.93、124.67±6.03,各组间均无统计学差别(p0.05)。Western Blot及q RT-PCR检测结果显示:加药24h,ALDH1的蛋白及m RNA水平随药物浓度增加而逐渐升高,组间比较有统计学差别(p0.05)。结论:r Apoptin不能有效抑制MCF-7细胞中的乳腺癌干细胞,其可能被乳腺癌干细胞的多药耐药机制所抵抗。
[Abstract]:Apoptin is the only functional protein to induce apoptosis of breast cancer , breast cancer stem cells and its related mechanisms . The effect of r Apoptin on the growth inhibition rate of MCF - 7 cells was investigated by means of CCK - 8 method . The inhibition rate of growth inhibition of MCF - 7 cells increased gradually from 6.67 卤 1.10 % , 38.13 卤 2.48 % , 45.09 卤 3.60 % , 56.30 卤 4.59 % , 4.09 卤 3.60 % , 56.30 卤 4.59 % , 8.79 卤 6.08 % , 5.59 卤 4.36 % , 92.34 卤 1.00 % , 94.56 卤 0.99 % , respectively . The results showed that r Apoptin could inhibit the growth of MCF - 7 cells and induce apoptosis . The results showed that r Apoptin could inhibit the growth and apoptosis of tumor cells in MCF - 7 cells . The results showed that r Apoptin could inhibit the growth of tumor cells in MCF - 7 cells and induce apoptosis . The results showed that r Apoptin could inhibit the proliferation of breast cancer stem cells in MCF - 7 cells . The results showed that r Apoptin could inhibit the proliferation of breast cancer stem cells in MCF - 7 cells . The results showed that r Apoptin could not inhibit the proliferation of breast cancer stem cells in MCF - 7 cells .

【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

【参考文献】