原发性肝细胞癌根治术后近期复发转移相关蛋白Annexin A4的临床和基础研究

发布时间：2018-05-05 02:02

  本文选题：肝细胞癌 + Annexin　； 参考：《福建医科大学》2016年博士论文

【摘要】：原发性肝细胞癌(HCC,简称肝癌)是我国最常见的致命性恶性肿瘤之一,其病死率居恶性肿瘤死因的第二位。手术切除仍然是是目前原发性肝癌治疗的首选治疗方式,但是约有70%的患者术后会出现肝内复发或肝外的转移,其中大多数发生术后早期,这是直接导致肝癌患者预后不佳的最主要原因。因此,寻找切实有效的预测肝癌早期复发转移的生物分子标记,阐明其与肝癌复发转移的关系及相关分子机制,并以此为靶点进行针对性干预治疗,对于改善患者预后具有重要意义。Annexin A4蛋白属于膜联蛋白Annexins家族一员。目前大量研究证实其在卵巢癌、结肠癌、胃癌、肾癌、胰腺癌等多种肿瘤异常表达,与肿瘤发生发展密切相关。我们课题组前期开展的蛋白质组学研究结果显示,Annexin A4蛋白与肝癌近期复发转移有关,查阅相关文献发现其在肝癌中研究较少,而且具体作用机制如何还不明确。目的:1、检测Annexin A4蛋白在不同时期复发转移患者肝癌组织中的表达,结合临床病理资料,评价其对肝癌术后早期复发转移以及远期预后的预测价值;2、研宄Annexin A4基因过表达或沉默对于肝癌细胞增殖、凋亡、周期以及迁移侵袭等生物学行为的影响;3、初步探讨Annexin A4促进肝癌细胞侵袭转移可能的分子机制。方法:1、收集141例手术切除并经病理证实的临床肝癌组织标本,根据肝癌患者术后复发转移时间将其分为1年内复发转移组,1~2年复发转移组以及2年内未复发转移组,采用Q-PCR、Western blot、组织芯片及免疫组化技术检测Annexin A4在不同分组肝癌组织中的表达,结合临床病理资料及随访信息,研究Annexin A4与临床病理特征的相关性,探讨其对肝癌术后早期复发转移及总体生存率的预测价值;2、Q-PCR和Western blot检测Annexin A4在不同转移潜能肝癌细胞系中的表达;采用质粒转染和sh RNA介导的RNAi技术,构建Annexin A4基因过表达和稳定沉默的肝癌细胞系;CCK-8、流式细胞术,Transwell小室实验检测Annexin A4基因过表达或沉默对肝癌细胞增殖、凋亡、周期以及迁移侵袭等生物学行为的影响;裸鼠皮下成瘤以及原位移植(肿瘤组织接种到肝脏)实验,在体观察Annexin A4基因过表达和沉默对肝癌细胞致瘤能力以及体内转移能力的影响;3、比较蛋白质组学技术分析Annexin A4基因稳定转染或沉默后肝癌细胞的蛋白质表达谱变化,筛选与目的基因关联蛋白质。Q-PCR和Western blot对所获得的差异蛋白进行验证,初步探讨Annexin A4基因介导肝癌侵袭转移的分子机制。结果:1、Q-PCR和Western blot结果显示Annexin A4在1年内复发转移组和1~2年复发转移组的肝癌组织中m RNA及蛋白表达水平较2年内未复发转移组均有显著上调(P0.05),与我们此前的蛋白质谱分析结果一致。构建包含141例临床肝癌组织样本的组织芯片,免疫组化检测并结合临床病理资料分析,结果表明Annexin A4高表达与门静脉癌栓(P=0.03)及更高的BCLC分期(P=0.002)等侵袭性临床病理特征相关,而与年龄、性别、血清AFP水平、HBV-DNA、肝硬化、肿瘤分化程度、肿瘤数目、肿瘤直径大小、肿瘤包膜无关(P均0.05)。Kaplan-Meier生存分析表明高表达Annexin A4患者具有更高的转移复发率(Log-rank test,P0.001)及更差的总体生存率(Log-rank test,P0.001)。COX多因素分析显示Annexin A4是一个影响肝癌术后复发(P=0.032)与总体生存(P=0.009)的独立危险因素。2、Q-PCR和Western blot结果表明Annexin A4在不同转移潜能的肝癌细胞系中表达存在差异,其在低转移潜能的Hep G2细胞中表达量最低,在高转移潜能的MHCC-97H细胞中表达量最高。在此基础上,利用质粒转染和RNAi技术成功构建高表达Annexin A4的Hep G2细胞和稳定沉默Annexin A4表达的MHCC-97H细胞,细胞功能学试验结果显示,在Hep G2细胞中上调Annexin A4表达能显著增强肝癌细胞的体外迁移与侵袭能力,在MHCC-97H细胞中下调Annexin A4表达肝癌细胞的体外迁移与侵袭能力显著降低,而Annexin A4过表达或沉默对肝癌细胞增殖、凋亡、周期等生物学行为无明显影响;裸鼠皮下瘤以及原位移植实验结果显示,沉默Annexin A4表达不影响MHCC-97H细胞的皮下肿瘤生长速度,但可抑制肝内种植瘤发生远处肺转移。本研究中未观察到Annexin A4基因过表达对Hep G2细胞体内侵袭转移的影响,考虑与ATCC来源的Hep G2细胞较差的致瘤性及较低的转移能力有关。3、蛋白质组学质谱分析结果显示,Annexin A4基因的过表达或沉默引起一系列相关蛋白在数量和表达水平上发生相应的变化,其中包括N-Cadherin和Vimentin:过表达Annexin A4的Hep G2细胞与对照组细胞相比,N-Cadherin和Vimentin表达水平分别上调1.85倍和1.53倍;沉默Annexin A4的MHCC-97H细胞与对照组细胞相比,N-Cadherin和Vimentin分别下调了0.45倍和0.39倍,这一结果提示Annexin A4可能诱导了肝癌细胞发生EMT。光镜下细胞形态学观察发现,Hep G2细胞过表达Annexin A4后,细胞由多边形向梭形间质细胞形态转变,而MHCC-97H细胞沉默Annexin A4表达后,细胞出现从梭形的间质细胞形态向鹅卵石型的上皮细胞形态转变。Q-PCR和Western blot结果显示过表达Annexin A4的Hep G2细胞中,N-cadherin和Vimentin表达上调,而E-cadherin表达下降,伴有EMT转录因子Zeb1的表达增加。而与之相反的是,干扰Annexin A4表达的MHCC-97H细胞中,N-cadherin和Vimentin表达下降,而E-cadherin表达升高,同时伴有转录因子Zeb1的表达下调。而其他EMT转录调控因子Snail、Slug、Twist等,随着Annexin A4基因表达的改变其表达水平未见明显变化。结论:1、Annexin A4异常高表达与肝癌患者的术后预后密切相关,可以作为一个评估肝癌术后早期复发转移风险的肿瘤分子标记物;2、Annexin A4对肝癌细胞增殖、凋亡、周期等生物学行为无明显影响,但可显著增强肝癌细胞的侵袭转移能力;3、Annexin A4可能通过调控转录因子Zeb1的表达诱导肝癌细胞发生EMT进而促进肝癌细胞的侵袭转移能力,但是Annexin A4具体通过何种信号转导机制调控Zeb1有待后续进一步研究。
[Abstract]:Objective : To investigate the relationship between tumor recurrence and metastasis of hepatocellular carcinoma ( HCC ) in the early stage of liver cancer . The results were as follows : 1 銆，

本文编号：1845675