膜联蛋白A3在乳腺癌增殖及侵袭转移中作用的研究

发布时间：2018-05-06 19:10

本文选题：膜联蛋白A3 + 乳腺癌　；参考：《河北医科大学》2017年博士论文

【摘要】：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升,在欧美国家乳腺癌占女性恶性肿瘤的25%~30%。在我国,乳腺癌发病率已上升为女性恶性肿瘤第一位。了解乳腺癌发生、发展的分子机制对有效治疗乳腺癌,从而提高患者生存率有重要意义。因此,找到与乳腺癌诊断、分期和治疗相关的特异性生物学标志是一项重要的工作。膜联蛋白家族(Annexin,ANX)属于Ca(2+)调节的磷脂和膜结合蛋白,在细胞中参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动,并调控炎症反应、细胞分化和细胞骨架蛋白间的相互作用。ANX表达失调与人类疾病相关,其在肿瘤的发生、发展中可介导细胞信号通路、细胞运动,与肿瘤的侵袭转移、血管生成、细胞凋亡及抗药性有关。家族成员膜联蛋白A3(Annexin A3,ANXA3)在肿瘤的形成、增殖、凋亡和信号转导形成过程中都扮演着重要角色,ANXA3表达水平的改变,对肿瘤发生发展、转移、耐药性有重要影响。然而,ANXA3在不同肿瘤中的表达模式不同,提示ANXA3在不同肿瘤发生发展中可能起不同作用。如ANXA3表达上调与卵巢癌的耐药性、结直肠癌和胰腺癌的发生、发展以及肺腺癌、肝癌的转移呈正相关性;而ANXA3表达水平下调则表现为促进前列腺癌的发生、发展。因此,ANXA3可能成为肿瘤治疗的靶标,是一种潜在的与肿瘤细胞增殖、凋亡和信号转导及患者预后相关的生物学标志物。然而,ANXA3在乳腺癌中的表达、功能及作用机制仍不十分清楚。本研究分四部分对ANXA3在乳腺癌增殖及侵袭转移中的作用机制进行研究:第一部分:通过免疫组化Max Vision TM一步法检测原发性乳腺癌组织中ANXA3的表达情况,回顾性分析ANXA3与患者临床生物学特性的相关性。第二部分:通过应用荧光定量RT-PCR法、western-blot技术检测乳腺癌组织及正常乳腺组织中ANXA3 mRNA及蛋白表达水平,分析其与临床生物学特性的关系;采用流式细胞术方法检测乳腺癌组织及正常乳腺组织细胞周期,分析乳腺癌组织中anxa3mrna及蛋白表达水平与细胞增殖指数的相关性,旨在探讨anxa3在乳腺癌发展及转移中的作用。第三部分:采用rna干扰技术抑制乳腺癌mda-mb-231细胞anxa3基因表达,通过流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡;细胞划痕实验检测转染后细胞迁移能力;transwell实验检测转染后细胞侵袭能力,旨在探讨anxa3对乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响。第四部分:建立乳腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过绘制肿瘤生长曲线、应用活体成像技术、he染色分析、流式细胞术及荧光定量rt-pcr等方法观察抑制anxa3对移植瘤生长的影响。第一部分乳腺癌组织中膜联蛋白a3表达与其临床生物学特性关系的研究目的:本研究通过免疫组化maxvisiontm一步法检测原发性乳腺癌组织中膜联蛋白a3(annexina3,anxa3)的表达情况,分析anxa3与患者临床生物学特性的相关性,探讨anxa3在乳腺癌诊治中的临床价值。方法:收集2009年1月至2009年12月河北医科大学第四医院乳腺中心收治的、经病理确诊且有完整随访资料的309例原发性乳腺癌患者石蜡包埋组织标本。入选病例均为女性,年龄22-76岁,中位年龄为47岁。通过免疫组化maxvisiontm一步法检测原发性乳腺癌组织中anxa3的表达情况,分别将患者按照年龄(50岁145例、≥50岁164例)、月经状况(绝经前158例、绝经后151例)、肿瘤大小(≤2cm117例、2cm且≤5cm160例、5cm32例)、淋巴结转移(无淋巴结转移129例、转移淋巴结1~3枚108例、转移淋巴结3枚72例)、临床tnm分期(Ⅰ期54例、Ⅱ期221例、Ⅲ期34例)、组织学分级(Ⅰ级35例、Ⅱ级192例、Ⅲ级82例)、分子亚型(luminala型65例、luminalb型148例、her2过表达型37例、三阴性59例)进行分组,分析anxa3与上述临床生物学特性的相关性。所有病例均由乳腺中心进行电话随访,随访时间截止至2015年6月,计算患者无病生存期(dfs)及总生存期(os)。采用cox回归模型进行多因素分析,观察anxa3及各临床生物学特性与患者预后的关系。结果:1无淋巴结转移组、淋巴结转移1~3枚组和淋巴结转移3枚组anxa3阳性表达率分别是51.94%,67.59%,73.61%,三组间阳性表达率的差异有统计学意义(χ2=11.123,p0.05)。2根据术后病理组织学分级,分为Ⅰ级组、Ⅱ级组、Ⅲ级组anxa3阳性表达率分别是31.42%,65.10%,69.51%,三组间anxa3阳性表达率的差异有统计学意义(χ2=16.686,p0.05)。3anxa3表达水平与年龄、月经状况、肿瘤大小及临床tnm分期无关(p0.05)。luminala型、luminalb型、her2过表达型、三阴性型anxa3阳性表达率分别是58.46%,58.11%,59.46%,79.66%,anxa3在三阴性乳腺癌患者中阳性表达率(79.66%)明显高于其他类型(χ2=9.226,p0.05)。4截止至2015年6月,309例患者随访时间为66~78个月,中位随访时间71个月。71个月dfs为68.93%(213/309),死亡58例,71个月os为81.23%(251/309),采用cox回归模型进行多因素分析,结果显示淋巴结转移数量和anxa3表达水平则被分别认定为影响dfs和os的独立危险因素,两者对dfs的相关危险度分别为2.181和1.569,对os的相关危险度分别是2.052和1.698。结论:1anxa3表达水平与乳腺癌患者年龄、月经状况、肿瘤大小及临床tnm分期无关。2anxa3表达水平与乳腺癌淋巴结转移数量、组织学分级及分子分型有关,在淋巴结转移3枚、组织分化Ⅲ级及三阴性乳腺癌患者中阳性表达率提高。3anxa3阳性表达者dfs低于阴性表达者,两者间os的差异无统计学意义,但anxa3阳性表达者os有降低趋势。4淋巴结转移数量和anxa3表达水平则被分别认定为影响乳腺癌患者dfs和os的独立危险因素。5anxa3可作为潜在判断乳腺癌生物学行为、指导判断患者无病生存期及总生存期的生物学标志物。第二部分膜联蛋白a3mrna及蛋白在正常乳腺组织及乳腺癌组织中的表达及意义目的:分析膜联蛋白a3(annexina3,anxa3)mrna及蛋白在正常乳腺组织及不同分化程度乳腺癌组织中的表达,探讨anxa3在乳腺癌发生、发展及转移中的作用及意义。方法:选取河北医科大学第四医院乳腺中心2015年4月至2015年10月资料完整的乳腺癌组织标本81例,患者均为女性,年龄29~80岁,中位年龄50岁。依照第三版who制定的病理分类方案,术后病理:浸润性导管癌66例、浸润性小叶癌4例、浸润性导管-小叶混合癌2例,筛状癌1例、分泌性癌1例,导管内癌7例;依照2010年ajcc第7版tnm分期,Ⅰ期11例、Ⅱ期50例、Ⅲ期19例、iv期1例;于常规取材时,在距癌灶7cm处随机切取乳腺组织0.5cm×0.5cm大小,并经病理诊断证实为正常腺体组织,作为对照组。采用荧光定量rt-pcr法检测乳腺癌组织及正常乳腺组织中anxa3mrna水平;利用western-blot技术检测乳腺癌组织及正常乳腺组织中anxa3蛋白表达水平;分析乳腺癌组织中anxa3mrna和蛋白表达水平与年龄、月经状况、临床分期、肿瘤大小、病理组织学分级、淋巴结转移状况、分子分型等临床生物学指标的关系。采用流式细胞术方法检测乳腺癌组织及正常乳腺组织细胞周期,比较乳腺癌组织与正常乳腺组织细胞增殖指数及anxa3mrna及蛋白表达水平与细胞增殖指数的相关性。结果:1乳腺癌组织中anxa3mrna水平(0.0667±0.0314)显著高于正常乳腺组织中anxa3mrna水平(0.0273±0.0268)(p0.01)。anxa3蛋白在乳腺癌组织中表达水平(0.68±0.10)显著高于在乳腺正常组织中的表达(0.25±0.07)(p0.01)。2乳腺癌患者淋巴结转移数量3个者anxa3mrna水平(0.0815±0.0306)显著高于无淋巴结转移者(0.0577±0.0363),亦高于淋巴结转移数量1~3个者(0.0733±0.0030)(p0.05)。有脉管瘤栓者anxa3mrna水平(0.0841±0.0321)高于无脉管瘤栓者(0.0607±0.0232)(p0.05)。乳腺癌组织中anxa3mrna及蛋白表达水平均与年龄、月经状况、临床tnm分期、肿瘤大小及组织学分级无关(p0.05)。3三阴性乳腺癌患者anxa3mrna水平(0.0943±0.0281)高于luminala型者(0.0627±0.0185)、luminalb型者(0.0631±0.0301)、her2过表达者(0.0647±0.0434)(p0.05)。乳腺癌患者淋巴结转移数量3个者anxa3蛋白表达水平(0.76±0.09)显著高于无淋巴结转移者(0.65±0.08)、亦高于淋巴结转移数量1~3个者(0.68±0.12)(p0.05),有脉管瘤栓者anxa3蛋白表达水平(0.71±0.10)高于无脉管瘤栓者(0.65±0.09)(p0.05),三阴性乳腺癌患者anxa3蛋白表达水平(0.81±0.06)高于luminala型者(0.64±0.10)、luminalb型者(0.67±0.10)、her2过表达者(0.69±0.13)(p0.05)。4乳腺癌组织g0/1期细胞为(58.85±9.32)%,s期细胞为(20.09±13.16)%,g2/m期细胞为(21.06±13.69)%;正常乳腺组织g0/1期细胞为(82.52±3.86)%,s期细胞为(6.57±5.37)%,g2/m期细胞为(10.91±5.70)%。与正常乳腺组织相比,乳腺癌组织g0/1期细胞显著降低(p0.01)。乳腺癌组织细胞增殖指数(41.15±9.32)%较正常乳腺组织细胞增殖指数(17.48±3.86)%显著增高(p0.01)。5乳腺癌组织中anxa3mrna及蛋白表达水平与细胞增殖指数呈正相关性,(pearson相关系数=0.304,p=0.006;pearson相关系数=0.341,p=0.002)。结论:1乳腺癌组织中anxa3mrna及蛋白表达水平显著高于正常乳腺组织。2乳腺癌组织中anxa3mrna及蛋白表达水平与淋巴结转移状态有关,在淋巴结转移数量3个组表达最高;有脉管瘤栓者anxa3mrna及蛋白表达水平高于无脉管瘤栓者;三阴性乳腺癌anxa3mrna及蛋白表达水平高于其他分子分型。3乳腺癌组织中anxa3mrna及蛋白表达水平与细胞增殖指数呈正相关性。4乳腺癌组织中anxa3mrna及蛋白表达水平与患者年龄、月经状况、肿瘤大小及临床tnm分期、病理组织学分级无关。anxa3可能参与并促进了乳腺癌的发生、发展及增殖、转移的过程。第三部分膜联蛋白a3对乳腺癌细胞增殖及侵袭影响的研究目的:本部分以乳腺癌细胞株为研究对象进一步观察乳腺癌细胞株中膜联蛋白a3(annexina3,anxa3)表达及抑制anxa3表达后乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的改变,探讨anxa3在乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭中的作用机制。方法:选取高侵袭性人乳腺癌细胞株mda-mb-231及低侵袭性人乳腺癌细胞株mcf-7,荧光定量rt-pcr检测mda-mb-231及mcf-7细胞中anxa3mrna水平;western-blot方法检测mda-mb-231及mcf-7细胞中anxa3蛋白表达水平。选择高表达anxa3的mda-mb-231细胞株进一步实验。成功构建了3个针对anxa3基因的shrna质粒,经脂质体法转染mda-mb-231细胞,发现anxa3-sh2对mda-mb-231细胞中anxa3mrna抑制效率最高。筛选出稳定转染细胞命名为mda-mb-231-sh,转染nc质粒的细胞命名为mda-mb-231-nc。实验分为三组观察:转染组为转染anxa3-sh2质粒的mda-mb-231-sh,空转组为转染阴性对照质粒的mda-mb-231-nc,对照组为未转染质粒的mda-mb-231。western-blot方法检测三组anxa3蛋白表达。流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡;细胞划痕实验检测转染后细胞迁移能力;transwell实验检测转染后细胞侵袭能力。结果:1mda-mb-231细胞anxa3mrna相对表达量(0.0696±0.0248)与mcf-7细胞anxa3mrna相对表达量(0.0236±0.0149)相比显著增高(p0.01)。mda-mb-231细胞anxa3蛋白相对表达量(0.76±0.02)显著高于mcf-7细胞中anxa3蛋白相对表达量(0.40±0.02)(p0.01)。2转染组(mda-mb-231-sh)细胞中anxa3蛋白表达量显著低于空转组(mda-mb-231-nc)及对照组(mda-mb-231)细胞中的表达量(p0.01)。3流式细胞术检测转染细胞增殖周期结果显示,转染组(mda-mb-231-sh)中g0/1期细胞为(59.27±0.87)%,s期细胞为(24.73±1.68)%,g2/m期细胞为(15.93±1.15)%;空转组(mda-mb-231-nc)细胞中g0/1期细胞为(53.63±1.80)%,s期细胞为(31.60±2.17)%,g2/m期细胞为(14.08±0.35)%;对照组(mda-mb-231)细胞中g0/1期细胞为(52.40±2.91)%,s期细胞为(34.60±3.56)%,g2/m期细胞为(13.00±1.48)%。转染组(mda-mb-231-sh)细胞g0/1期显著高于空转组(mda-mb-231-nc)及对照组(mda-mb-231)细胞g0/1期(p0.05)。mda-mb-231-sh细胞增殖指数(proliferationindex,pi)(40.67±0.93)%显著低于mda-mb-231-nc(46.40±1.85)%及mda-mb-231细胞pi值(47.60±2.91)%(p0.05)。流式细胞术检测转染细胞凋亡率结果显示,转染组(mda-mb-231-sh)细胞凋亡率(6.73±0.33)%显著高于空转组(mda-mb-231-nc)(3.58±0.23)%及对照组(mda-mb-231)细胞(3.09±0.33)%(p0.01)。4细胞划痕实验显示转染组(mda-mb-231-sh)细胞迁移能力低于空转组(mda-mb-231-nc)及对照组(mda-mb-231)细胞。transwell侵袭实验显示转染组(mda-mb-231-sh)细胞穿膜细胞数少于空转组(mda-mb-231-nc)及对照组(mda-mb-231)细胞。结论:1高侵袭性人乳腺癌细胞株mda-mb-231中anxa3mrna及蛋白表达水平均高于低侵袭性人乳腺癌细胞株mcf-7。2成功构建了3个针对anxa3基因的shrna质粒,其中h_anxa3-sh2转染效率最高,抑制anxa3效果最好。3通过抑制anxa3表达mda-mb-231细胞细胞凋亡率显著升高而细胞增殖指数显著降低,侵袭、迁移能力下降。anxa3亦有可能成为一个可用于乳腺癌诊断、治疗和预后评估的潜在的生物学标志物。第四部分膜联蛋白a3对乳腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长影响的研究目的:建立乳腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察抑制膜联蛋白a3(annexina3,anxa3)表达对乳腺癌细胞皮下移植瘤生长的影响,进而验证anxa3对乳腺癌细胞增殖的调控作用。方法:使用第三部分实验中制备的乳腺癌细胞mda-mb-231、mda-mb-231-sh及mda-mb-231-nc,建立荷瘤裸鼠动物模型。将18只裸鼠随机分为3组,每组6只,接种mda-mb-231细胞者为对照组;接种mda-mb-231-nc细胞者为空转组;接种mda-mb-231-sh细胞者为转染组。自皮下移植瘤开始生长起持续观察4周,记录三组裸鼠的精神、饮食及排便情况,每周测量一次裸鼠的体重及皮下种植瘤的长、短径,绘制肿瘤生长曲线。应用活体成像技术检测皮下移植瘤活性程度。he染色分析三组移植瘤组织结构。采用流式细胞术及荧光定量rt-pcr检测裸鼠皮下移植瘤的细胞增殖周期及anxa3mrna水平,记录并比较上述指标在三组裸鼠间的差异。结果:1三组裸鼠分别接种MDA-MB-231、MDA-MB-231-NC及MDA-MB-231-Sh细胞后,10d左右开始成瘤,成瘤率达100%。2生长曲线显示:转染组裸鼠皮下移植瘤较对照组及空转组生长缓慢。活体成像技术检测显示:转染组移植瘤生长活性低于对照组及空转组。转染组皮下移植瘤质量及体积[(58.55±31.92)mg及(90.62±74.44)mm3]与对照组[(222.40±133.40)mg及(239.30±110.90)mm3]及空转组[(239.30±110.90)mg及(406.72±95.23)mm3]相比,皮下移植瘤质量及体积显著降低,P0.01。3 HE染色显示:对照组及空转组皮下移植瘤组织细胞丰富,核分裂象多见,瘤组织中有丰富的血管;转染组皮下移植瘤细胞稀疏,有大量纤维结缔组织增生,瘤组织间血管较少。4转染组裸鼠皮下移植瘤细胞中ANXA3 m RNA水平(0.0071±0.0021)显著低于对照组(0.0671±0.0087)及空转组(0.0698±0.0104),P0.01。转染组裸鼠皮下移植瘤细胞中ANXA3蛋白表达水平(0.26±0.02)显著低于对照组(0.72±0.04)及空转组(0.71±0.06),P0.01。5流式细胞术检测结果显示,转染组G0/1期细胞为(73.84±3.92)%,S期细胞为(5.57±1.60)%,G2/M期细胞为(20.41±4.85)%;对照组G0/1期细胞为(57.43±2.60)%,S期细胞为(23.15±2.29)%,G2/M期细胞为(19.41±1.39)%;空转组G0/1期细胞为(57.57±2.97)%,S期细胞为(23.63±3.79)%,G2/M期细胞为(18.81±1.94)%。转染组裸鼠皮下移植瘤细胞增殖指数(26.17±3.92)%显著低于对照组(42.57±2.60)%及空转组(42.43±2.97)%,P0.01,而转染组G0/1期细胞显著高于对照组及空转组,P0.01。结论:1抑制MDA-MB-231细胞ANXA3表达后,可使转染组裸鼠皮下移植瘤较对照组及空转组生长缓慢,且皮下移植瘤质量及体积显著降低,活性程度降低;HE染色下观察转染组皮下移植瘤细胞稀疏,有大量的纤维结缔组织增生,瘤组织间血管较少。2转染组裸鼠皮下移植瘤细胞中ANXA3 m RNA及蛋白表达水平显著低于对照组及空转组。3转染组裸鼠皮下移植瘤细胞增殖指数较对照组及空转组显著降低,而G0/1期细胞显著升高。4沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞中ANXA3表达,可以调控乳腺癌细胞增殖凋亡,抑制乳腺癌细胞生长。ANXA3可能成为乳腺癌基因治疗新的潜在靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

【参考文献】