ART1调节饥饿诱导的结肠癌细胞自噬及其对癌细胞增殖凋亡影响的研究

发布时间：2018-05-07 21:17

本文选题：自噬 + ART1　；参考：《重庆医科大学》2015年博士论文

【摘要】：研究背景及目的：随着我国居民饮食结构和生活习惯改变等因素的影响,大肠癌的发病率已呈明显上升趋势,但大肠癌的治疗效果却不佳。自噬水平的升高可以提高大肠癌对肿瘤药物的抵御能力,帮助大肠癌细胞的继续生长。自噬对大肠癌的发生发展具有促进作用。因此,探索大肠癌中调节自噬的分子机制有利于了解自噬的调节因素,并为找寻大肠癌新的治疗靶点提供实验依据。ART1和PARP-1分别可催化单个或多个ADP核糖至目标蛋白特定的氨基酸位点促进单ADP核糖基化作用或聚ADP核糖基化作用。本课题组前期分别研究ART1和PARP-1对大肠癌发生发展的作用,结果显示,抑制ART1和PARP-1均可抑制大肠癌肿瘤的增殖和侵袭能力,ART1和PARP-1在顺铂诱导的结肠癌细胞凋亡中具有协同作用。另有文献报道,单ADP核糖基化作用可能是聚ADP核糖基化作用的基础,我们推测PARP-1可能会受到ART1的调节。亦有文献报道,PARP-1可通过mTOR对自噬发挥调节作用。因此,本课题拟在前期研究基础之上,在小鼠结肠癌CT26细胞研究ART1对饥饿诱导的自噬的影响及分子机制。自噬在生物学过程中,常与凋亡和增殖有一定关联,我们也将进一步探讨ART1调节饥饿诱导的自噬对结肠癌细胞凋亡和增殖的影响。方法：本研究分为三部分：1.研究ART1对饥饿诱导的结肠癌细胞自噬的影响。(1)采用D-Hand液体饥饿处理CT26细胞诱导自噬小体的形成,以慢病毒为载体转染的ART1基因沉默CT26细胞(ART1-shRNA CT26细胞)、ART1基因过表达CT26细胞(GFP-ART1 CT26细胞)为实验组,以慢病毒空载体转染的CT26细胞(Vector CT26细胞)和未转染CT26细胞(Untransfected CT26细胞)为对照组,通过电镜、吖啶橙荧光染色方法检测饥饿诱导的各组CT26细胞自噬小体形成的变化以及未经饥饿诱导的各组CT26细胞自噬小体形成情况,观察ART1对饥饿诱导的小鼠结肠癌CT26细胞自噬小体形成的影响(2)采用RT-PCR和Western Blot分别检测饥饿诱导的ART1-shRNA CT26细胞、Vector CT26细胞、GFP-ART1 CT26细胞和Untransfected CT26细胞以及饥饿诱导的Balb/c小鼠ART1-shRNA CT26细胞、Vector CT26细胞、GFP-ART1CT26细胞和Untransfected CT26细胞皮下移植瘤组织中自噬标记蛋白LC3A和LC3B的mRNA和蛋白变化,进一步了解ART1对自噬标记蛋白LC3A和LC3B表达的影响。2.研究ART1对饥饿诱导的结肠癌细胞自噬影响的分子机制。(1)采用免疫组化方法检测人大肠癌组织中PARP-1和ART1的表达及两者的相关性,并通过ART1抑制剂MIBG和PARP-1抑制剂5-AIQ处理CT26细胞,细胞免疫荧光双标记检测ART1与PARP-1的变化,进一步探讨ART1和PARP-1之间的作用关系。采用免疫共沉淀检测饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞和Vector CT26细胞中ART1和Integrina7是否存在相互作用。采用Western Blot检测PARP-1和Rac1抑制剂对饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞自噬标记蛋白LC3A和LC3B的影响；饥饿诱导的ART1-shRNA CT26细胞、Vector CT26细胞、GFP-ART1 CT26细胞和Untransfected CT26细胞以及饥饿诱导的Balb/c小鼠ART1-shRNA CT26细胞、Vector CT26细胞、GFP-ART1 CT26细胞和Untransfected CT26细胞移植瘤组织中Racl和PAPR-1蛋白水平改变；PARP-1和Rac1抑制剂对饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞中Racl、PARP-1、NF-κB和NF-κB蛋白表达的影响,探讨ART1在饥饿诱导的结肠癌细胞中是否通过integrina7/Rac1/NF-κB对PARP-1表达进行调节。(2) WesternBlot分别检测饥饿诱导的ART1-shRNA CT26细胞、Vector CT26细胞、GFP-ART1 CT26细胞和Untransfected CT26细胞以及饥饿诱导的Balb/c小鼠ART1-shRNA CT26细胞Vector CT26细胞、GFP-ART1 CT26细胞和Untransfected CT26细胞皮下移植瘤组织中LKB1、p-AMPK和p-p70S6蛋白水平；检测PARP-1和Racl抑制剂对饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞p-AMPK和p-p70S6K蛋白表达的影响,探讨ART1是否通过Rac1、PARP-1调节LKB1/AMPK/mTOR途径进而对CT26细胞饥饿诱导的自噬发挥作用。3.研究ART1调节饥饿诱导的结肠癌细胞自噬对癌细胞增殖凋亡的影响。(1)自噬抑制剂3-MA处理饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞采用CCK-8、软琼脂细胞集落形成和流式细胞术检测细胞增殖的变化；皮下接种GFP-ART1 CT26细胞并进行饥饿诱导自噬的BALB/c小鼠腹腔注射3-MA观察皮下移植瘤成瘤情况,观察饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞自噬抑制对细胞增殖的影响。(2)自噬抑制剂3-MA处理饥饿诱导的GFP-ART1CT26细胞采用流式细胞术、Hochest33342和caspase3活性检测细胞凋亡的变化：皮下接种GFP-ART1 CT26细胞并进行饥饿诱导自噬的BALB/c小鼠腹腔注射3-MA后检测移植瘤组织中caspase3活性,观察饥饿诱导的GFP-ART1CT26细胞自噬抑制对细胞凋亡的影响。结果：1.ARTl对饥饿诱导结肠癌细胞自噬的影响。(1)ART1对饥饿诱导的小鼠结肠癌CT26细胞自噬小体形成的影响：1)电镜下观察,未经过饥饿诱导的ART1-shRNACT26细胞、Vector CT26细胞、GFP-ART1 CT26细胞和Untransfected CT26细胞中均未见自噬小体。在饥饿诱导条件下,与Vector CT26细胞和Untransfected CT26相比,GFP-ART1 CT26细胞可见较多的自噬小体,而ART1-shRNA CT26细胞中几乎未见自噬小体,但是可见明显的细胞凋亡现象。2)吖啶橙荧光染色结果显示,在未经过饥饿诱导的ART1-shRNA CT26细胞、Vector CT26细胞、GFP-ART1 CT26细胞和Untransfected CT26细胞中均未见橘红色荧光。与饥饿诱导的VectorCT26细胞和Untransfected CT26细胞相比,饥饿诱导的GFP-ART1CT26细胞中橘红色荧光最强；饥饿诱导的ART1-shRNA CT26细胞中橘红色荧光非常弱。3)流式细胞术定量分析吖啶橙红色荧光强度,结果显示,饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞中橘红色荧光强度高于饥饿诱导的Vector CT26细胞和Untransfected CT26细胞；饥饿诱导的ART1-shRNA CT26细胞中橘红色荧光低于饥饿诱导的Vector CT26细胞和Untransfected CT26田胞(P0.01)。(2)ART1对饥饿诱导的结肠癌细胞自噬标记蛋白LC3A和LC3B的影响。RT-PCR和Western Blot结果显示,饥饿诱导的ART1-shRNACT26细胞和饥饿诱导的ART1-shRNA CT26细胞皮下移植瘤中LC3A、LC3B mRNA水平和LC3B/LC3A蛋白比值低于空载对照组和未转染组(P0.05),饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞和饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞皮下移植瘤的LC3A、LC3B mRNA水平和LC3B/LC3A蛋白比值则高于空载对照组和未转染组(P0.05)。2.ART1对饥饿诱导的结肠癌细胞自噬影响的分子机制。(1)饥饿诱导的结肠癌细胞中ART1与integrina7/Racl/NF-κB及PARP-1关系：1)免疫组化结果显示,在人大肠癌组织中,ART1和PARP-1表达强度均高于对照黏膜组织,且PAPR-1和ART1在人大肠癌组织中阳性表达具有相关性。PARP-1和ART1在大肠癌中阳性表达与肿瘤的淋巴结转移也具有相关性。2)ART1抑制剂MIBG和PARP-1抑制剂5-AIQ分别处理CT26细胞,免疫荧光双标记检测结果显示,与未用抑制剂处理的CT26细胞相比,MIBG处理的CT26细胞PARP-1和ART1表达均降低(P0.05)；而5-AIQ处理的CT26细胞仅有PARP-1表达降低(P0.05), ART1表达没有明显变化(P0.05)。3)免疫共沉淀方法检测到ART1和integrinα7在饥饿诱导的CT26细胞中具有相互作用。4) Western Blot检测显示,PARP-1抑制剂5-AIQ或Rac1抑制剂NSC23766处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞LC3 B/LC3A蛋白比值均低于未用相应抑制剂处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞(P0.05)。5) Western blot检测显示,饥饿诱导的ART1-shRNA CT26细胞和饥饿诱导的ART1-shRNA CT26细胞皮下移植瘤中Rac1和PAPR-1蛋白表达水平低于空载对照组和未转染组(P0.05),饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞和饥饿诱导的GFP-ART1CT26细胞皮下移植瘤中的Rac1和PAPR-1蛋白表达水平则高于空载对照组和未转染组(P0.01)。6)在饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞中,分别应用Rac1和PARP-1抑制剂处理后,结果显示,Rac1抑制剂处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞PAPR-1和细胞核NF-κB蛋白水平低于未用抑制剂处理的GFP-ART1 CT26细胞(P0.05)。Racl的表达则在PARP-1抑制剂处理的和未用抑制剂处理的饥饿诱导GFP-ART1 CT26细胞之间无明显差异(P0.05)。(2)饥饿诱导的结肠癌细胞中ART1与LKB1/AMPK/mTOR关系：1)Western Blot检测,饥饿诱导的ARTl-shRNA CT26细胞和饥饿诱导的ART1-shRNA CT26细胞皮下移植瘤LKB1和p-AMPK蛋白表达水平低于空载对照组和未转染组(P0.05),饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞和饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞皮下移植瘤LKB1和p-AMPK蛋白表达水平则高于空载对照组和未转染组(P0.01)。饥饿诱导的ART1-shRNA CT26细胞和饥饿诱导的ART1-shRNA CT26细胞皮下移植瘤中p-p70S6K蛋白水平高于空载对照组和未转染组(P0.01),饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞和饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞皮下移植瘤中p-p70S6K蛋白水平低于空载对照组和未转染组(P0.01)。2) Westernblot检测Rac1和PARP-1抑制剂处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞p-AMPK和p-p70S6K变化。与未用抑制剂处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞相比,Rac1抑制剂或PARP-1抑制剂处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞p-AMPK蛋白水平降低(P0.05)。p-p70S6K在Rac1抑制剂或PARP-1抑制剂处理的的饥饿诱导GFP-ART1 CT26细胞中表达升高(P0.05)。3.ART1调节饥饿诱导的结肠癌细胞自噬对癌细胞增殖凋亡的影响。(1)ART1调节的饥饿诱导CT26细胞自噬对癌细胞增殖的影响。1)采用CCK-8观察不同浓度的自噬抑制剂3-MA对饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞增殖水平的影响,结果显示,在一定范围内,随着3-MA浓度逐渐增加饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞的生长抑制率也逐渐增加。5mM 3-MA抑制饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细增殖的效果强于1 mM和3mM 3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞(P0.05)。但是5 mM 3-MA对饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞抑制率和7mM 3-MA对饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞抑制率之间无明显差异(P0.05)。2)软琼脂集落形成实验结果显示,3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞集落形成率低于未用3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞(P0.05)。3)流式细胞术检测结果显示,与未用3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞相比,3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞在细胞周期中分布比例发生变化,S期和G2期所占比例缩小以及细胞增殖指数降低(P0.05)。4)皮下接种GFP-ART1 CT26细胞并进行饥饿诱导自噬的BALB/c小鼠腹腔注射3-MA后观察皮下移植瘤体积和重量的变化。结果显示,3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞移植瘤体积和重量均小于未用3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞移植瘤(P0.05)。(2)ART1调节的饥饿诱导CT26细胞自噬对癌细胞凋亡的影响。1)流式细胞术检测自噬抑制剂3-MA对饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞凋亡的影响。结果显示,3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1CT26细胞凋亡率明显高于未用3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1CT26细胞(P0.01)。2) Hochest33342染色观察3-MA对饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞凋亡的影响,结果显示,3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞凋亡率高于未用3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞(P0.01)。3)3-MA对的饥饿诱导的GFP-ART1CT26细胞caspase3活性的影响,结果显示,3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1CT26细胞和caspase3活性高于未用3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1CT26细胞(P0.05)；皮下接种GFP-ART1 CT26细胞并进行饥饿诱导自噬的BALB/c小鼠腹腔注射3-MA后检测皮下移植瘤组织caspase3活性的变化,结果显示,3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞移植瘤中caspase3活性高于未用3-MA处理的饥饿诱导的GFP-ART1 CT26细胞移植瘤(P0.05)。结论：1.ART1高表达可促进饥饿诱导的CT26细胞自噬小体的形成,ARTl沉默可抑制饥饿诱导的CT26细胞自噬小体的形成,ART1对结肠癌CT26细胞饥饿诱导的自噬具有调节作用。2.ART1可通过integrina7相互作用,调节Rac1、NF-κB、PARP-1、AMPK和mTOR信号通路,在饥饿诱导的CT26细胞自噬形成中发挥作用。3.抑制ART1促进的饥饿诱导的CT26细胞自噬,可以抑制该细胞增殖和促进该细胞凋亡。ART1可能成为新的大肠癌治疗靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35

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