基于Cell-SELEX胶质肉瘤与胶质瘤干细胞核酸适配体的筛选及初步应用研究

发布时间：2018-05-08 02:04

本文选题：胶质肉瘤 + 胶质瘤干细胞　；参考：《福建医科大学》2016年博士论文

【摘要】：目的:1.通过体外筛选获得针对脑胶质肉瘤细胞特异性的、高亲和力的核酸适配体,用于识别胶质肉瘤细胞和临床脑胶质肉瘤病理组织。2.通过体外筛选获得针对脑胶质瘤干细胞特异性的、高亲和力的核酸适配体,作为一种新的分子探针用于胶质瘤干细胞的鉴定和分选。方法:1.通过化学合成一个随机寡核苷酸文库,包含分别为18个碱基的前、后引物区,以及含45个碱基的随机核苷酸区。采用Cell-SELEX(配体指数富集系统进化)技术,以取自临床脑胶质肉瘤的病理组织,经原代培养、传代而获得的细胞系k308作为靶细胞,以正常脑星形胶质细胞SVGp12作为对照细胞,经过施加不同的筛选条件,使DNA文库不断富集;随后将富集的DNA文库进行PCR扩增、克隆测序,得到候选的核酸适配体并进一步表征。以测定平衡解离常数K_d值来评估核酸适配体的亲和力;选取胶质瘤细胞U251、U87、T98G以及来源于乳腺、结肠、肝、宫颈、肺的癌细胞以流式细胞术分析核酸适配体的选择性。另外分别选取临床脑胶质肉瘤病理组织切片以及其它器官来源的肿瘤组织切片,用激光共聚焦显微镜组织成像技术检测核酸适配体的识别能力。2.合成一个序列长度为80个碱基的随机寡核苷酸文库:5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-40N-AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3’。以胶质瘤干细胞为正筛细胞,经CD133磁珠分选,免疫细胞化学染色及Western-Blot、RT-PCR等方法鉴定;以胶质瘤细胞U87作为反筛细胞,采用Cell-SELEX技术,得到候选的核酸适配体并进一步表征。测定其平衡解离常数K_d值,用激光共聚焦荧光显微镜检测核酸适配体的识别能力。选择U251、T98G、k308、Hu H-7、Hela、SW480、MDA-MB-231以及胶质瘤干细胞经分化后的细胞,以流式细胞术分析核酸适配体的选择性。用胰酶消化方式来考察核酸适配体靶标性质。通过同CD133蛋白、CD133抗体结合及竞争实验进一步考察核酸适配体实际应用。结果:1.经过16个循环的筛选,最终获得5条特异靶向胶质肉瘤细胞的核酸适配体。这些核酸适配体K_d值介于10-100 nmol/L,流式细胞术及激光共聚焦显微镜检测发现他们可以特异性地结合胶质肉瘤细胞,将其中亲和力和特异性最佳的核酸适配体WQY-9序列进一步优化,得到序列长度为63个碱基的核酸适配体WQY-9-B,测定其K_d值为23±5 n M,能够在4℃和37℃条件下识别胶质肉瘤细胞,而不与U251、U87、T98G及其他组织来源的癌细胞发生结合。经胰蛋白酶消化处理后的胶质肉瘤细胞k308,核酸适配体WQY-9-B不能再与之结合;同时用WQY-9-B检测临床胶质肉瘤病理组织切片的阳性率为73.3%,对来源于其他器官的肿瘤组织几乎不结合。2.胶质瘤干细胞具有成球生长、多向分化、裸鼠移植成瘤的干细胞特性。经过20个循环的筛选,最终获得5条特异靶向胶质瘤干细胞的核酸适配体。其中核酸适配体W5的亲和力和特异性均最佳,K_d值为4.9±1.4 n M,选择W5进行序列截短优化,得到序列长度为66个碱基的核酸适配体W5-7,测定K_d值为4.4±1.1 n M。流式细胞术及激光共聚焦显微镜检测发现W5-7在4℃和37℃时具有同样识别胶质瘤干细胞的能力。与经过胰蛋白酶预先处理后的胶质瘤干细胞孵育,W5-7丧失原有的结合力;同时W5-7能够识别CD133阳性表达的胶质瘤干细胞,但不结合CD133蛋白,与CD133抗体在胶质瘤干细胞上的结合不存在竞争关系。结论:1.所得到胶质肉瘤的核酸适配体WQY-9及WQY-9-B具有特异性以及高亲和力;可以用于区分胶质肉瘤与胶质瘤细胞;核酸适配体WQY-9-B的靶标可能为胶质肉瘤细胞表面的某种膜蛋白;WQY-9-B具有针对临床胶质肉瘤病理组织优良的识别能力,可以作为胶质肉瘤的一种分子探针,将在胶质肉瘤的早期诊断、靶向递药、改善预后等方面发挥重要作用。2.所得到胶质瘤干细胞的核酸适配体W5及W5-7具有高亲和力和特异性;可以区分胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞及其他组织来源的肿瘤细胞;W5-7可以对胶质瘤干细胞进行成像;W5-7的靶标可能为胶质瘤干细胞表面的某种膜蛋白;W5-7可以替代CD133抗体来鉴定和分选胶质瘤干细胞,并用以甄定出胶质瘤干细胞的特异性标记物;将对实现从胶质瘤源头上的精准诊疗,提高胶质瘤的整体疗效等方面具有重要的临床意义。
[Abstract]:Objective : 1 . To obtain a nucleic acid aptamer with high affinity for glioma stem cells and to identify the affinity of nucleic acid aptamer by using cell - SELEX ( ligand index enrichment system evolution ) . Human glioma stem cells ( WQY - 9 - B ) were screened by trypsinization . The results were as follows : 1 . The results were as follows : 1 . The affinity and specificity of CD133 protein and CD133 antibody could not be combined with those of U251 , U87 , T98G and other tissues . It has important clinical significance to realize accurate diagnosis and treatment from the source of glioma and improve the overall curative effect of glioma .

【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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