基于Cell-SELEX胶质肉瘤与胶质瘤干细胞核酸适配体的筛选及初步应用研究
本文选题:胶质肉瘤 + 胶质瘤干细胞 ; 参考:《福建医科大学》2016年博士论文
【摘要】:目的:1.通过体外筛选获得针对脑胶质肉瘤细胞特异性的、高亲和力的核酸适配体,用于识别胶质肉瘤细胞和临床脑胶质肉瘤病理组织。2.通过体外筛选获得针对脑胶质瘤干细胞特异性的、高亲和力的核酸适配体,作为一种新的分子探针用于胶质瘤干细胞的鉴定和分选。方法:1.通过化学合成一个随机寡核苷酸文库,包含分别为18个碱基的前、后引物区,以及含45个碱基的随机核苷酸区。采用Cell-SELEX(配体指数富集系统进化)技术,以取自临床脑胶质肉瘤的病理组织,经原代培养、传代而获得的细胞系k308作为靶细胞,以正常脑星形胶质细胞SVGp12作为对照细胞,经过施加不同的筛选条件,使DNA文库不断富集;随后将富集的DNA文库进行PCR扩增、克隆测序,得到候选的核酸适配体并进一步表征。以测定平衡解离常数K_d值来评估核酸适配体的亲和力;选取胶质瘤细胞U251、U87、T98G以及来源于乳腺、结肠、肝、宫颈、肺的癌细胞以流式细胞术分析核酸适配体的选择性。另外分别选取临床脑胶质肉瘤病理组织切片以及其它器官来源的肿瘤组织切片,用激光共聚焦显微镜组织成像技术检测核酸适配体的识别能力。2.合成一个序列长度为80个碱基的随机寡核苷酸文库:5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-40N-AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3’。以胶质瘤干细胞为正筛细胞,经CD133磁珠分选,免疫细胞化学染色及Western-Blot、RT-PCR等方法鉴定;以胶质瘤细胞U87作为反筛细胞,采用Cell-SELEX技术,得到候选的核酸适配体并进一步表征。测定其平衡解离常数K_d值,用激光共聚焦荧光显微镜检测核酸适配体的识别能力。选择U251、T98G、k308、Hu H-7、Hela、SW480、MDA-MB-231以及胶质瘤干细胞经分化后的细胞,以流式细胞术分析核酸适配体的选择性。用胰酶消化方式来考察核酸适配体靶标性质。通过同CD133蛋白、CD133抗体结合及竞争实验进一步考察核酸适配体实际应用。结果:1.经过16个循环的筛选,最终获得5条特异靶向胶质肉瘤细胞的核酸适配体。这些核酸适配体K_d值介于10-100 nmol/L,流式细胞术及激光共聚焦显微镜检测发现他们可以特异性地结合胶质肉瘤细胞,将其中亲和力和特异性最佳的核酸适配体WQY-9序列进一步优化,得到序列长度为63个碱基的核酸适配体WQY-9-B,测定其K_d值为23±5 n M,能够在4℃和37℃条件下识别胶质肉瘤细胞,而不与U251、U87、T98G及其他组织来源的癌细胞发生结合。经胰蛋白酶消化处理后的胶质肉瘤细胞k308,核酸适配体WQY-9-B不能再与之结合;同时用WQY-9-B检测临床胶质肉瘤病理组织切片的阳性率为73.3%,对来源于其他器官的肿瘤组织几乎不结合。2.胶质瘤干细胞具有成球生长、多向分化、裸鼠移植成瘤的干细胞特性。经过20个循环的筛选,最终获得5条特异靶向胶质瘤干细胞的核酸适配体。其中核酸适配体W5的亲和力和特异性均最佳,K_d值为4.9±1.4 n M,选择W5进行序列截短优化,得到序列长度为66个碱基的核酸适配体W5-7,测定K_d值为4.4±1.1 n M。流式细胞术及激光共聚焦显微镜检测发现W5-7在4℃和37℃时具有同样识别胶质瘤干细胞的能力。与经过胰蛋白酶预先处理后的胶质瘤干细胞孵育,W5-7丧失原有的结合力;同时W5-7能够识别CD133阳性表达的胶质瘤干细胞,但不结合CD133蛋白,与CD133抗体在胶质瘤干细胞上的结合不存在竞争关系。结论:1.所得到胶质肉瘤的核酸适配体WQY-9及WQY-9-B具有特异性以及高亲和力;可以用于区分胶质肉瘤与胶质瘤细胞;核酸适配体WQY-9-B的靶标可能为胶质肉瘤细胞表面的某种膜蛋白;WQY-9-B具有针对临床胶质肉瘤病理组织优良的识别能力,可以作为胶质肉瘤的一种分子探针,将在胶质肉瘤的早期诊断、靶向递药、改善预后等方面发挥重要作用。2.所得到胶质瘤干细胞的核酸适配体W5及W5-7具有高亲和力和特异性;可以区分胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞及其他组织来源的肿瘤细胞;W5-7可以对胶质瘤干细胞进行成像;W5-7的靶标可能为胶质瘤干细胞表面的某种膜蛋白;W5-7可以替代CD133抗体来鉴定和分选胶质瘤干细胞,并用以甄定出胶质瘤干细胞的特异性标记物;将对实现从胶质瘤源头上的精准诊疗,提高胶质瘤的整体疗效等方面具有重要的临床意义。
[Abstract]:Objective : 1 . To obtain a nucleic acid aptamer with high affinity for glioma stem cells and to identify the affinity of nucleic acid aptamer by using cell - SELEX ( ligand index enrichment system evolution ) . Human glioma stem cells ( WQY - 9 - B ) were screened by trypsinization . The results were as follows : 1 . The results were as follows : 1 . The affinity and specificity of CD133 protein and CD133 antibody could not be combined with those of U251 , U87 , T98G and other tissues . It has important clinical significance to realize accurate diagnosis and treatment from the source of glioma and improve the overall curative effect of glioma .
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R739.41
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 梁红茹;杨松涛;张涛;胡桂秋;夏咸柱;;核酸适配体及其在病原微生物学中的应用[J];生物工程学报;2011年05期
2 姚远;张波;;核酸适配体及其应用研究进展[J];国际检验医学杂志;2014年08期
3 甘龙杰;兰小鹏;;适配体芯片技术及其应用[J];临床检验杂志;2009年06期
4 兰小鹏;;适配体技术及其在医学检验研究中的作用[J];临床检验杂志;2012年10期
5 李晓佩;杨良嵘;黄昆;李文松;孙西同;刘会洲;;核酸适配体在生化分离及检测领域中的研究进展[J];化工学报;2013年01期
6 刘婷先;张娜;;适配体在肿瘤治疗方面的应用[J];生命的化学;2013年05期
7 唐德平;张宇洁;毛爱红;;适配体在体外细胞检测中的应用[J];重庆医学;2014年13期
8 李红玉;阎辉;;适配体与病毒性感染诊断及治疗[J];中国生物化学与分子生物学报;2013年05期
9 满燕;吕雪飞;彭广;宋达;庆宏;;双适配体夹心微阵列芯片在凝血酶检测中的应用[J];生命科学仪器;2014年Z1期
10 胡燕;杨先达;;核酸适配体在肿瘤学中的应用研究进展[J];基础医学与临床;2012年03期
相关会议论文 前10条
1 蔡圣;刘彩云;卢建忠;;基于核酸适配体和酶循环放大的腺苷化学发光检测[A];中国化学会第十届全国发光分析学术研讨会论文集[C];2011年
2 陈巍;赵新颖;屈锋;;毛细管电泳法筛选蛋白质的核酸适配体的初步研究[A];全国生物医药色谱学术交流会(2010景德镇)论文集[C];2010年
3 杨晓娟;邴涛;梅宏成;上官棣华;;核酸适配体用于手性拆分L型和D型色氨酸[A];全国生物医药色谱学术交流会(2010景德镇)论文集[C];2010年
4 郑冬梅;娄新徽;;一种基于结构开关型适配体的无标记荧光传感法[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年
5 薛利云;周小明;邢达;;基于核酸适配体探针和酶辅助荧光信号扩增的等温高灵敏度蛋白检测方法[A];中国光学学会2011年学术大会摘要集[C];2011年
6 马文韬;古力;屈锋;;毛细管电泳筛选大肠杆菌适配体的初步研究[A];全国生物医药色谱学术交流会(2010景德镇)论文集[C];2010年
7 梁好均;徐华国;邓伟;;核酸适配体链构象转变的研究[A];2014年两岸三地高分子液晶态与超分子有序结构学术研讨会摘要集[C];2014年
8 王晓芳;程琳;耿霞;赵强;;基于适配体修饰的磁珠和量子点荧光法检测凝血酶[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年
9 汪海林;章大鹏;;单核苷水平核酸适配体与蛋白质相互作用分析[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年
10 温桂清;范燕燕;梁爱惠;蒋治良;;核酸适配体纳米金共振散射光谱检测血清中钾离子[A];中国化学会第十五届全国有机分析及生物分析学术研讨会论文集[C];2009年
相关重要报纸文章 前2条
1 潘文;核酸适配体在医药领域应用前景广阔[N];中国医药报;2010年
2 于洋 田野;蛋白质检测有了新方法[N];吉林日报;2011年
相关博士学位论文 前10条
1 黄玉坤;基于核酸适配体识别-时间分辨荧光纳米探针的生物毒素检测方法研究[D];江南大学;2015年
2 陈霞;功能核酸的筛选及在分析检测中的应用[D];武汉大学;2012年
3 林雪霞;微流控芯片与可控适配体技术用于细胞代谢物分析及其相互作用的研究[D];北京化工大学;2015年
4 周庆同;生物相空间中的适配体和药物虚拟筛选[D];中国科学技术大学;2015年
5 郭业民;基于适配体传感器的牛奶中抗生素残留快速检测技术研究[D];东北农业大学;2015年
6 李菁菁;适配体功能化的荧光纳米探针用于蛋白和细胞传感研究[D];南京大学;2012年
7 于鸽;乙丙肝病毒相互干扰及适配体在肝癌诊断及靶向治疗中的作用[D];吉林大学;2016年
8 王成全;基于磁控适配体传感体系的农产品中典型霉菌毒素检测研究[D];江苏大学;2016年
9 姜红岩;自组装RNA适配体纳米传感器[D];北京协和医学院;2016年
10 胡波;海洋聚醚类毒素基于适配体的检测及生物合成的探索[D];第二军医大学;2016年
相关硕士学位论文 前10条
1 张月侠;蛋白质寡核苷酸适配体的筛选与应用研究[D];山东师范大学;2009年
2 李慧玲;BHL DNA适配体对铜绿假单胞菌群体感应系统抑制作用的研究[D];福建医科大学;2015年
3 刘金钏;适配体纳米金比色法灵敏度影响因素研究及其在食品安全检测中的应用[D];中国农业科学院;2015年
4 于连元;核酸适配体修饰的纳米颗粒在肿瘤靶向免疫治疗及靶向热疗中的应用[D];北京协和医学院;2015年
5 赵变军;基于适配体特异性作用的乳腺癌细胞表面多种肿瘤标记物同时检测的新方法研究[D];南京师范大学;2015年
6 乔醴峰;基于核酸适配体的β-葡萄糖醛酸苷酶一步纯化固定化研究及其应用[D];石河子大学;2015年
7 吕莉;基于适配体的酶联吸光度法检测血小板衍生生长因子-BB[D];山西大学;2015年
8 陈艳霞;核酸适配体/小檗碱荧光体系的构筑及分析应用[D];山西大学;2015年
9 吕琴;基于荧光标记适配体的荧光各向异性法检测小分子[D];山西大学;2015年
10 朱志玲;基于核酸适配体的赭曲霉毒素A SPR检测技术研究[D];北京化工大学;2015年
,本文编号:1859458
本文链接:https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zlx/1859458.html