近端胃癌中Caveolin-1基因的表观遗传学调控机制及其对表皮生长因子受体2活化的影响

发布时间：2018-05-08 20:38

本文选题：近端胃癌 + Cav-1基因　；参考：《河北医科大学》2016年博士论文

【摘要】：目的:胃癌(Gastric cancer,GC)是常见的上消化道恶性肿瘤,早期常无特异性症状,多数病人就诊时已属中晚期,治疗效果差,死亡率较高,严重威胁着广大人民的身体健康。研究表明,远端胃癌(Distal gastric cancer,DGC)的发病率呈下降趋势,而近端胃癌(Proximal gastric cancer,PGC)的发病率则呈明显增高的趋势,尤其是中国北部的太行山脉。近端胃癌已成为河北省的高发肿瘤,并且具有较强的家族聚集性。多年来,尽管对高发区胃癌的防治做了大量的工作,但其发病率和死亡率仍居高不下。因此,探索胃癌尤其是近端胃癌的发病机制及寻找有效的基因治疗靶点,是降低胃癌发病率及死亡率的重要途径。Caveolin-1(Cav-1)基因位于人染色体7q31.2,编码22KDa的具有脚手架功能的小凹蛋白,是细胞膜表面小凹结构的主要成分。研究表明该蛋白链N端的脚手架区域可通过识别特定的序列,与多种信号分子结合并调节其活性,如受体酪氨酸激酶等,影响多种信号转导过程,进而参与了细胞的恶性转化、增殖、侵袭等众多恶性生物学行为。但Cav-1在不同的细胞环境下,其发挥的作用不尽相同。研究发现Cav-1的表达在不同肿瘤,同一肿瘤不同亚型或同一肿瘤发展的不同阶段均是不同的。Cav-1在近端胃癌中的表达情况及其表达调控机制仍未见报导。表观遗传学改变,尤其是基因启动子区Cp G岛的高甲基化现象是调节基因转录的主要机制之一。在对多种肿瘤的研究中均发现了Cav-1基因的甲基化失活现象,如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肝细胞癌等,然而,研究发现在不同的肿瘤中该基因的甲基化频率及基因甲基化对转录的影响却不尽相同。近些年,一些研究提出了关键性Cp G位点的概念,也就是说基因启动子区每一个CpG位点的甲基化频率并不相同,而与基因转录抑制密切相关的CpG位点称为关键性CpG位点,可能位于CpG岛内或CpG岛旁。关键性CpG区域的高频率甲基化可通过阻碍多种转录因子与启动子结合,降低或完全抑制了基因的转录水平,甚至还可改变蛋白和dna的相互作用,导致染色质结构的改变。序列检索软件及cpg岛预测软件发现cav-1基因在其启动子区含有一较大的cpg岛,推测基因甲基化可能是引起其表达异常的机制之一。本研究拟检测cav-1基因的甲基化水平对基因转录的影响以及其关键性cpg位点区域。人类表皮生长因子受体(humanepidermalgrowthfactorreceptor,egfr)是一类具有酪氨酸激酶活性的高同源性蛋白质,该家族包括四个成员,其中人表皮生长因子受体2(egfr2;her-2)是其主要成员之一。her-2可通过与该家族的其它成员形成二聚体,并通过与egfr样配体结合,导致胞内酪氨酸激酶区域上的酪氨酸磷酸化,进而激活胞内一系列信号转导如mapk、pi3k/akt、stat、plc等途径,且作用较不含her-2的异源二聚体更强。已有研究证实,cav-1可直接与egfr相连接,从而调控egfr酪氨酸激酶的活性,影响肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。而胃癌中cav-1对her-2活化的影响尚未见报导。本研究立足于河北省太行山脉上消化道肿瘤高发现场,收集大量散发性及家族聚集性近端胃癌患者的癌及相应癌旁组织标本,并结合细胞学实验,以期明确(1)cav-1基因的表达调控机制及其关键性甲基化区域,并探讨该基因关键性甲基化区域的甲基化状态作为预后指标的可行性;以期利用表观遗传学修饰的可逆性,为肿瘤的治疗提供新的分子靶点,并为肿瘤的预后判断提供新的线索。(2)cav-1在胃癌中的具体作用及其对her-2活化的影响,探讨cav-1调控表皮生长因子受体2活化在胃癌发病中的作用,对于胃癌发病的分子机制的明确,提高患者的生存率具有重要意义。本研究拟分以下三个部分:第一部分caveolin-1对体外培养胃癌细胞株生物学行为的影响及其表达调控机制探讨方法:1细胞培养及药物处理常规培养bgc-823,mkn45,nci-n87三株胃癌细胞株,待细胞密度较低且处于对数生长期时,分别用5μmol/l的甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-aza-dc)处理72小时或0.3μmol/l组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素a(trichostatina,tsa)处理24小时,期间每24h更换一次培养液,处理完毕后更换为完全培基继续培养,24h后收集细胞,提取dna及rna,进行后续检测。2利用逆转录-聚合酶链反应(transcription-polymerasechainreaction,rt-pcr)的方法检测不同胃癌细胞株中cav-1基因mrna的表达情况常规培养bgc-823,mkn45,nci-n87三株胃癌细胞株,并检测药物处理前后cav-1基因mrna的表达水平。3利用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specificpolymerasechainreaction,msp)的方法检测不同胃癌细胞株中cav-1基因的甲基化状态常规培养bgc-823,mkn45,nci-n87三株胃癌细胞株,并检测药物处理前后cav-1基因的甲基化水平。4建立cav-1过表达的稳转胃癌细胞株n87/cav-1将含人全长cav-1基因的pcdna3.1质粒和空载体质粒分别转染至低表达cav-1的人胃癌细胞株nci-n87中,经g418抗性筛选,得到过表达cav-1的稳转胃癌细胞株n87/cav-1及对照组细胞株n87/pcdna3.1。5mtt比色分析法检测cav-1过表达及5-aza-dc处理对nci-n87细胞株细胞增殖能力的影响将对数生长期的n87/pcdna3.1及n87/cav-1细胞以及5-aza-dc处理72小时后nci-n87细胞分别消化并接种于96孔板,测定各孔吸光度值,检测细胞的增殖能力。6划痕修复(woundhealing)实验检测cav-1过表达及5-aza-dc处理对nci-n87细胞株细胞迁移能力的影响将对数生长期的nci-n87、n87/pcdna3.1及n87/cav-1细胞分别消化并接种于24孔板,其中nci-n87细胞株用5-aza-dc处理72h后,用10μl移液器吸头垂直于孔底划一条直线,显微镜下观察不同时间点划痕愈合情况。结果:1不同胃癌细胞株在5-aza-dc及tsa处理前后cav-1基因mrna表达情况利用rt-pcr的方检测三株胃癌细胞株bgc-823,mkn45,nci-n87中cav-1基因mrna的表达水平,发现mkn45,bgc-823细胞株中cav-1基因mrna呈强阳性表达,而nci-n87细胞株中该基因呈弱表达。应用甲基化抑制剂5-aza-dc处理三株胃癌细胞株后,发现mkn45及bgc-823细胞株中cav-1基因mrna表达没有发生明显变化,而nci-n87细胞株在5-aza-dc处理后cav-1基因mrna表达明显上调;而应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa处理三株胃癌细胞株后,发现mkn45、bgc-823及nci-n87细胞株中该基因mrna表达均无明显变化。2不同胃癌细胞株在5-aza-dc及tsa处理前后cav-1基因不同区域甲基化状态检测利用msp的方法检测mkn45、bgc-823及nci-n87细胞株中cav-1基因启动子区不同区域的甲基化情况,结果显示,应用5-aza-dc处理前,胃癌细胞株nci-n87四个检测区域均可扩增出甲基化条带,处理后,四个区域的甲基化条带均减弱或消失;而mkn45、bgc-823在应用5-aza-dc处理前后均未扩增出甲基化条带。3过表达cav-1基因及5-aza-dc处理对nci-n87胃癌细胞株增殖能力的影响利用mtt实验检测cav-1基因对胃癌细胞增殖能力的影响。结果表明,过表达cav-1基因以及5-aza-dc处理后会导致nci-n87细胞增殖能力明显下降,且差异有统计学意义(p0.05)。4过表达cav-1基因及5-aza-dc处理对nci-n87胃癌细胞迁移能力的影响采用woundhealing的方法检测胃癌细胞的迁移能力。结果表明,过表达cav-1基因以及5-aza-dc处理后会导致nci-n87细胞迁移能力明显下降,且差异有统计学意义(p0.05)。第二部分近端胃癌组织标本中caveolin-1的异常表达及其甲基化状态检测方法:1研究对象:选取河北医科大学第四医院胸外科2006年-2009年收治的近端胃癌患者172例,所有患者均来自河北省上消化道肿瘤高发区。每例患者均取癌组织原发灶及距癌组织边缘2~5cm处的癌旁组织。癌组织均为胃腺癌且癌组织的癌中心位于齿状线上1cm及齿状线以下2cm范围内;癌旁组织均为非肿瘤组织,包括正常黏膜组织和增生的黏膜组织。本研究经医院伦理委员会审查通过,并经所有患者知情同意并签署知情同意书。2分别利用rt-pcr及免疫组织化学(immunohistochemistry,ihc)的方法检测172例癌及癌旁组织标本中cav-1基因mrna及蛋白表达的情况。3利用msp的方法检测172例癌及癌旁组织标本中cav-1基因不同区域的甲基化状态。4应用亚硫酸氢钠测序法(bisulfitegenomicsequencing,bgs)的方法检测5对癌及癌旁组织标本中cav-1基因每个cpg位点的甲基化频率。结果:1近端胃癌患者癌及癌旁组织标本中cav-1基因mrna及蛋白的表达情况rt-pcr的方法检测近端胃癌患者癌及相应癌旁非肿瘤组织中cav-1基因mrna的表达情况,结果显示,172例癌组织中cav-1基因的mrna表达量为0.418±0.143,其表达量明显低于癌旁非肿瘤组织(0.684±0.219,t=-14.486,p=0.000)。应用ihc法检测172例近端胃癌患者癌及癌旁非肿瘤组织中cav-1蛋白的表达情况,结果显示癌组织中cav-1蛋白的阳性表达率为39.5%(68/172),明显低于癌旁组织(77.3%,133/104,χ2=50.565,p=0.000)。胃癌组织中cav-1基因的mrna及蛋白表达仅与上消化道肿瘤家族史相关(p0.05),而与年龄、性别、病理分级、临床分期及淋巴结转移均无关(p0.05)。2近端胃癌患者癌及癌旁组织中cav-1基因不同区域甲基化状态的检测172例胃癌组织及相应癌旁组织均成功进行了msp检测。结果显示,癌及癌旁组织中cav-1基因在msp1,msp2,msp3,msp4四个区域的甲基化频率分别为51.7%(89/172)和27.3%(47/172),23.8%(41/172)和1.2%(2/172),33.1%(57/172)和26.2%(45/172),45.3%(78/172)和37.8%(65/172),癌组织中四个区域的甲基化频率均明显高于癌旁非肿瘤组织,但仅有msp1和msp2两个区域的甲基化差别具有统计学意义(χ2msp1=21.451,p=0.000;χ2msp2=40.425,p=0.000)。应用bgs的方法对-590bp~-143bp以及-286~498bp两个片段的52个cpg位点进行了测序,结果显示,肿瘤组织中每个gpg位点的甲基化频率均高于癌旁组织相应的cpg位点。msp1区域的甲基化状态与临床分期、淋巴结转移及上消化道肿瘤家族史相关(p0.05);msp2区域的甲基化状态与临床分期、淋巴结转移及上消化道肿瘤家族史相关(p0.05);而msp3、msp4两个区域的甲基化状态与各临床病理参数均无关(p0.05)。3胃癌组织中cav-1基因不同区域甲基化状态对其mrna及蛋白表达的影响msp1及msp2区域发生甲基化的胃癌组中cav-1基因mrna及蛋白的表达均明显高于未发生该区域甲基化的胃癌组织,且差异有统计学意义(p0.05);而msp3及msp4区域的甲基化状态与cav-1基因的mrna及蛋白的表达无明显相关性(p0.05)。4生存分析cav-1蛋白表达与胃癌患者的生存期无关(χ2=2.698,p=0.100,log-ranktest);cav-1基因msp1及msp2两区域发生甲基化的胃癌患者其五年生存率明显高于未发生该区域甲基化的胃癌患者,cav-1基因msp1及msp2两区域的甲基化状态与胃癌患者的生存率有关(χ2msp1=41.679,pmsp10.001;χ2msp2=34.927,pmsp20.001;log-ranktest);msp1、msp2两区域共同发生甲基化的胃癌患者较单一区域甲基化的患者或未发生甲基化的患者其预后更差(χ2=53.167,p0.001,log-ranktest);肿瘤分期为iii/iv期且合并msp1或msp2区域甲基化的胃癌患者(χ2=46.352,p0.001,log-ranktest)或者上消化道肿瘤家族史阳性且合并msp1或msp2区域甲基化的胃癌患者(χ2=38.265,p0.001,log-ranktest)其预后较差;cox分析结果显示msp1区域的甲基化状态、tnm分期以及上消化道肿瘤家族史是近端胃癌患者独立的预后因素(p0.05)。第三部分caveolin-1对体外培养胃癌细胞株中her-2活化的影响方法:1westernblot法检测不同胃癌细胞株中cav-1及her-2蛋白的表达情况常规培养胃癌细胞株ags、mkn28、sgc7901、bgc823、mkn45、nci-n87,westernblot法检测各细胞株中cav-1及her-2蛋白的表达水平。2稳转细胞系的建立选取her-2高表达而cav-1蛋白弱表达的nci-n87细胞建立cav-1过表达的稳转细胞系n87/cav-1;westernblot法验证稳转结果。3mtt比色分析法观察配体诱导下cav-1过表达对nci-n87胃癌细胞株的增殖能力的影响。将对数生长期的n87/pcdna3.1及n87/cav-1细胞分别消化并接种于96孔板,细胞饥饿培养4h后,分别用不同浓度的egf进行刺激(0nm、4nm、20nm、100nm),48h后,加入mtt,测定各孔吸光度值,检测细胞的增殖能力。4利用划痕修复实验观察配体诱导下cav-1过表达对nci-n87胃癌细胞株迁移能力的影响将对数生长期的n87/pcdna3.1及n87/cav-1细胞分别消化并接种于24孔板,饥饿4h后,用10μl移液器吸头垂直于孔底划一条直线,分为无egf刺激组和20nmegf刺激组。倒置显微镜下观察细胞的迁移情况。5平板克隆形成实验检测配体诱导下cav-1过表达对nci-n87细胞贴壁克隆生长的变化选取生长状态良好的对数生长期的n87/pcdna3.1及n87/cav-1细胞,将细胞消化吹打为单细胞混悬液,接种于35mm培养皿(800个细胞/皿)。分别在有或无egf(20nm)刺激下,苏木素染色,显微镜下观察,并计算各组细胞克隆形成率。结果:1应用westernblot法检测ags、mkn28、sgc7901、bgc823、mkn45、nci-n87六株胃癌细胞系中cav-1蛋白及her-2蛋白的表达情况,结果显示:mkn28、sgc7901细胞株中cav-1蛋白强表达,bgc823、mkn45ags、nci-n87细胞株中cav-1蛋白表达呈阴性或弱表达;而her-2蛋白在mkn28、nci-n87细胞株中呈阳性表达,在其它细胞系中均为阴性或弱表达。2选取her-2高表达而cav-1蛋白弱表达的nci-n87细胞建立cav-1过表达的稳转细胞系n87/cav-1;westernblot法验证了稳转效果。3在egf配体诱导下cav-1蛋白对nci-n87细胞生物学行为的影响应用mtt的方法检测配体诱导下cav-1蛋白对nci-n87细胞增殖能力的影响,在不同浓度egf(0nm,4nm,20nm,100nm)刺激下,cav-1稳转细胞系n87/cav-1其细胞的增殖能力均明显低于阴性对照组n87/pcdna3.1(t0nm=13.718,p0.001;t4nm=20.777,p0.001;t0nm=12.623,p0.001;t0nm=9.788,p0.001)。应用平板克隆形成实验检测配体诱导下cav-1过表达对nci-n87细胞贴壁克隆生长的变化:经10%胎牛血清及1%胎牛血清+20nmegf培基培养2周后,过表达cav-1的n87/cav-1细胞组较n87/pcdna3.1细胞组细胞克隆形成能力减弱(59.183±5.982%vs.47.983±5.294%;36.583±4.147%vs.28.483±3.186%),且差异有统计学意义(t10%胎牛血清=3.434,p0.001;tegf=3.794,p0.001)。利用划痕修复实验观察配体诱导下cav-1过表达对nci-n87胃癌细胞株迁移能力的影响:结果显示,在有或无egf刺激下,过表达cav-1的n87/cav-1细胞其迁移能力在12h、24h、36h、48h时间点均低于阴性对照组n87/pcdna3.1(p0.05)。4在配体诱导下cav-1蛋白对her-2活化的影响预饥饿的cav-1过表达稳转细胞系n87/cav-1及阴性对照细胞系n87/pcdna3.1分别接受egf(20nm)刺激0、5、10、30分钟,应用westernblot检测cav-1、her-2、p-her-2及抗磷酸化酪氨酸抗体4g10的表达情况,结果显示,在有或无egf刺激下,her-2蛋白的总表达量无明显变化,而cav-1过表达细胞系n87/cav-1对p-her-2及4g10的表达量有明显的抑制作用(p0.05)。5在配体诱导下cav-1蛋白对mapk、pi3k/akt信号通路的影响westernblot检测egf刺激0、5、10、30分钟后n87/cav-1及n87/pcdna3.1细胞株中mapk、pi3k/akt信号通路的下游分子erk、p-erk及akt、p-akt的表达水平。结果显示,在egf刺激下,p-erk及p-akt表达均较无egf刺激时明显增高;egf刺激条件下n87/cav-1细胞各时间点(5、10、30分钟)p-erk及p-akt的磷酸化比率均明显低于对照组N87/pcDNA3.1(P0.01)。结论:1 Cav-1基因CpG岛旁及转录起始点区域的高甲基化状态是引起其表达下调的主要机制之一;2 Cav-1基因CpG岛旁(MSP1)区域可作为近端胃癌患者独立的预后因素,有望成为近端胃癌患者预后评估的指标之一;3 Cav-1通过调控Her-2的磷酸化水平,抑制了MAPK、PI3K/Akt信号通路下游关键分子P-ERK及P-Akt的磷酸化水平,进而对胃癌细胞的增殖及迁移起到了一定的抑制作用,影响胃癌的进程。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

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