肝细胞癌中miR-26a的表达调控机制及其诊断价值的研究

发布时间：2018-05-09 10:16

本文选题：肝细胞癌 + miR-26a　；参考：《华中科技大学》2016年博士论文

【摘要】：第一部分EZH2介导启动子区域H3K27me3抑制miR-26a表达目的：从表观遗传角度探讨肝细胞癌(Hepatocelluar carcinoma, HCC)中miR-26a的表达调控机制,阐述EZH2调控miR-26a表达的分子机理。方法：利用qRT-PCR和Western blot的方法验证HCC细胞系(HepG2、SMMC7721)中niR-26a和EZH2的表达水平：构建并运用EZH2过表达和沉默质粒上调或下调HepG2、SMMC7721或正常永生化肝细胞系L02中EZH2表达水平,qRT-PCR方法检测miR-26a表达变化；构建miR-26a启动子报告基因质粒,利用报告基因技术分析EZH2对]miR-26a启动子转录活性的影响；利用染色质免疫共沉淀技术验证EZH2是否通过介导启动子H3K27me3抑制miR-26a表达。结果：iR-26a在HepG2和SMMC7721中表达水平低于L02细胞,EZH2在HepG2和SMMC7721中表达水平高于L02细胞。下调HepG2和SMMC7721细胞中EZH2表达明显上调miR-26a表达水平,上调L02中EZH2表达明显降低miR-26a表达水平。沉默EZH2增强miR-26a启动子报告基因的荧光素酶活性。miR-26a启动子区域存在EZH2和H3K27me3的结合和富集,沉默EZH2后结合富集减弱。结论：HCC细胞系中miR-26a低表达而EZH2高表达。EZH2可通过介导启动子H3K27me3抑制miR-26a的表达。第二部分miR-26a靶向抑制EZH2的研究目的：验证HCC中miR-26a对EHZ2的靶向关系.方法：向HepG2或SMMC7721细胞中转染不同浓度的miR-26a mimics,运用qRT-PCR和Western blot的方法检测EZH2的表达水平：构建EZH23’UTR野生型及突变型报告基因质粒,并与miR-26a mimics 或 Control mimics共转染至HepG2或SMMC7721细胞,双荧光素酶报告基因系统检测荧光强度。结果：与C ontrol mimics相比,转染niR-26a mimics的HCC细胞中EZH2的mRNA及蛋白水平明显降低,且miR-26a浓度越高EZH2表达降低越明显。成功构建EZH23'UTR野生型及突变型报告基因质粒。miR-26a mimics显著降低了EZH2 3'UTR野生型报告基因的荧光素酶活性,而EZH2 3'UTR突变型报告基因则不受miR-26a影响。结论：HCC中EZH2是miR-26a的直接靶点。第三部分EZH2-miR-26a双向负反馈环路调控肝癌细胞生长目的：验证EZH2-miR-26a双向负反馈环路的存在,探讨其对HCC细胞生长的影响。方法：在HepG2和SMMC7721细胞中转染miR-26a mimics,或同时过表达EZH2,运用qRT-PCR方法检测miR-26a宿主基因(CTDSPL/CTDSP2)和E-cadherin的表达水平。上调HepG2和SMMC7721细胞miR-26a表达水平或同时上调EZH2表达水平,或下调EZH2表达水平,运用CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果：转染外源性miR-26a mimics诱导内源性CTDSPL.CTDSP2和E-cadherin的表达,过表达EZH2消除了这种诱导作用。过表达miR-26a有效抑制HCC细胞增殖能力和克隆形成能力,而过表达EZH2消除了miR-26a对细胞增殖和克隆形成的抑制。和过表达miR-26a类似,沉默EZH2也可有效抑制HCC细胞增殖和克隆形成。结论：EZH2和miR-26a构成了双向负反馈环路调控HCC细胞生长。第四部分血清miR-26a作为肝细胞癌诊断标志物的研究目的：评估血清miR-26a对肝细胞癌的诊断价值。方法：收集52例HCC患者、42例慢性肝炎患者和43例健康对照的血清标本,运用qRt-PCR方法检测血清miR-21、miR-26a和miR-101的表达水平,运用受试者工作特征曲线(ROC)分析评估其诊断价值。结果：HCC患者血清中miR-21表达水平明显高于健康对照组,而miR-26a和miR-101表达水平明显低于慢性肝炎(Chronic Hepatitis,CH)患者组以及健康对照组。ROC曲线分析显示,血清miR-21、miR-26a和miR-101均可区分HCC患者和健康对照,ROC曲线下面积(AUC)分别为0.621(敏感性67.4%,特异性55.8%),0.754(敏感性51.9%,特异性95.2%)和0.631(敏感性47.1%,特异性81%),联合miRNAs和AFP具有更高的诊断价值(AUC=0.917,敏感性87%,特异性78%)。miR-26a和miR-101可区分HCC患者和CH患者,AUC分别达到0.762(敏感性75%,特异性70%)和0.623(敏感性54.9%,特异性76.9%)。miR-26a、miR-101和甲胎蛋白(AFP)联合诊断效果高于单独使用AFP(AUC,0.854 vs 0.683)。血清miR-26a可以区分小体积HCC(3cm)和CH患者,其AUC为0.753,敏感性和特异性分别达到80%和62.5%。结论：(1)血清miR-21、miR-26a、miR-101均可作为HCC的潜在诊断标志物。(2)联合miR-21、miR-26a、miR-101和AFP对HCC的诊断价值高于单独使用AFP。(3)血清miR-26a可作为HCC潜在的早期诊断标志物。
[Abstract]:The expression of miR - 26a in HCC cell line ( HepG2 and SMMC7721 ) was investigated by qRT - PCR and Western blot .
constructing a miR - 26a promoter reporter plasmid , and analyzing the influence of EZH2 on the transcriptional activity of the miR - 26a promoter by using a reporter gene technique ;
The expression level of EZH2 in HepG2 and SMMC7721 cells was lower than that of L02 cells . The ROC curve analysis showed that serum miR - 21 , miR - 26a and miR - 101 can distinguish HCC patients and healthy controls . The area under ROC curve ( AUC ) is 0.621 ( sensitivity 67.4 % , specificity 55.8 % ) , 0.754 ( sensitivity 51.9 % , specificity 95.2 % ) and 0.623 ( sensitivity 54.9 % , specificity 76.9 % ) . The combined diagnosis effect of miR - 26a , miR - 101 and AFP ( AFP ) is higher than that of AFP ( AUC , 0.854 vs 0.683 ) alone . Conclusion : ( 1 ) Serum miR - 21 , miR - 26a , miR - 101 can be used as potential diagnostic markers for HCC . Conclusion : ( 1 ) Serum miR - 21 , miR - 26a , miR - 101 and AFP can be used as potential diagnostic markers for HCC . ( 2 ) The diagnostic value of miR - 21 , miR - 26a , miR - 101 and AFP to HCC is higher than that of AFP alone . ( 3 ) Serum miR - 26a can be used as an early diagnostic marker for HCC .

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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