抗-ανβ3抗体介导磁性靶向脂质体的三步预定位法在乳腺癌肿瘤新生血管分子靶向成像中的应用及基于IVIM的MR扩散加权成像

发布时间：2018-05-10 06:39

本文选题：脂质体 + 乳腺癌　；参考：《南方医科大学》2015年博士论文

【摘要】：第一部分:抗-αvβ3抗体介导磁性靶向脂质体的三步预定位法在乳腺癌肿瘤新生血管分子靶向成像中的应用目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,亦是肿瘤致死的首要原因。钼靶X线及B超是目前最常用的乳腺癌筛查、诊断工具,但其空间分辨率较差、敏感性较低。MRI被认为是目前诊断乳腺癌最为有效的检查手段,特别是对于直径1 cm的病灶;但其应用仍受限于特异性较低。本项研究在前期工作的基础上(超顺磁性氧化铁脂质体合成的实验研究),继续深入新型磁性靶向MR对比剂的合成修饰及成像研究。首先开展高空间稳定、长循环主动靶向磁性脂质体的制备,分析其理化性质,评价其生物相容性,为MR免疫成像提供特异性靶向对比剂。其次,通过建立荷乳腺癌的动物模型,利用新型MR对比剂靶向增强整合素αvβ3受体,评价肿瘤新生血管的成像效果,从而实现早期、准确地发现乳腺癌病灶。材料与方法1.生物素-PEG修饰的以SPIO为核心结构的新型磁性靶向脂质体的制备及其理化特性检测1.1新型磁性被动及主动靶向脂质体的制备采用两步法制备:第一步,分别合成月桂酸稳定的SPIO及空白脂质体。应用化学共沉淀法制备出月桂酸包裹的SPIO,超声细胞粉碎仪作用10 min,转速4000r/min下离心15min,分离出SPIO溶液中较大的颗粒,常温、避光保存。应用薄膜分散法及超声振荡法,使DC15:1DSPG:DSPE-PEG2000-生物素(非靶向空白脂质体采用DSPE-PEG2000)按摩尔比20:1,总量0.3 mmol自发形成空白脂质体纳米颗粒。磷脂中加入0.2mol%的Rho-DHPE进行荧光标记。第二步,将空白脂质体与月桂酸稳定的SPIO按一定比例混合,在PH=7.4的缓冲液中透析72h,每8h换液一次,使磷脂双分子层自发取代SPIO表面的月桂酸,形成以SPIO为核心结构的被动靶向磁性脂质体(magnetoliposome,ML)及主动靶向磁性脂质体(biotinylated magnetoliposome,Bt-ML)。1.2 SPIO及新型磁性靶向脂质体的理化性质检测1.2.1透射电镜下月桂酸稳定的SPIO、空白脂质体、ML及Bt-ML的形态学观察及粒径测量各取一滴月桂酸稳定的SPIO、空白脂质体、ML及Bt-ML置于敷有支撑膜的铜网上,静置约5 min后,用滤纸小片从铜网边缘吸干多余液体,用1%的磷钨酸负染30 s后(SPIO无需负染),用滤纸小片从铜网边缘吸干多余液体,静置半小时后置于透射电镜下观察。1.2.2月桂酸稳定的SPIO、ML及Bt-ML的流体粒径测定分别吸取5μl的样品,去离子水3 ml稀释至比色皿中,使用Malvern-3000HS激光粒度测定仪测定其流体粒径及分布:所选激光光源的波长为633.0 nm,散射角为90°,测试温度为25 ℃。1.2.3采用原子吸收光谱法测定月桂酸稳定的SPIO、ML及Bt-ML的铁含量取3ml样品,使用王水(1 ml 65%HN03+ 2 ml 30%H202)消解样品中的Fe304,制成待测试液,于原子吸收光谱仪波长372.2 nm处测量其吸光度值。1.2.4 X线粉末衍射晶体结构分析分别取冷冻干燥的SPIO、MIL及Bt-ML研细,置于X线多晶粉末衍射仪中,采用镍过滤的CuKα射线,扫描速度为4θmin-1,扫描范围20为10°至90°。将所得图谱与国际粉末衍射标准联合会出版的PDF卡片比较,以此确定样品的晶体结构。1.2.5磁化率的测定精密称取冷冻干燥的SPIO、ML及Bt-ML适量,置于MPMSXL-7磁学性质测量系统中,测定温度为300K,磁场强度为-1T至+1T,测量样品的磁滞曲线。1.2.6 T2弛豫率的测定将铁浓度为 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mmol/L 的 SPIO、ML 及 Bt-ML 溶液分别装于直径lcm的试管中,使用MR头部线圈,扫描序列采用T2mapping,测量不同浓度各样品的T2值,拟合1/T2与铁浓度的线性方程,计算样品的T2弛豫率。2.评价新型磁性靶向脂质体的细胞毒性及体内外逃逸巨噬细胞吞噬的特性;2.1巨噬细胞的体外吞噬实验将RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)接种于培养皿中,37 ℃C,5%C02条件下培养24 h,细胞达到80-90%汇合后,以5 × 1 05个/孔接种于6孔细胞培养板中,经24 h培养后,分别加入含有SPIO、ML及Bt-ML的1640全培溶液2 ml(铁含量50 μg/ml)孵育24小时后,用PBS洗三遍,以不含样品的1640全培的细胞作为空白对照,每孔分别加入4%多聚甲醛溶液2 ml,固定20 min,PBS洗三遍后,每孔加入普鲁士蓝染液(含2%亚铁氰化钾和2%盐酸混合液)2 ml作用30 min后,PBS洗三遍,加入核固红染液作用5 min,PBS洗三遍后,倒置显微镜下观察。2.2家兔药物体内分布实验取新西兰大白兔SPF级6只(均为雌性,体重2.0-2.5kg),随机设为SPIO组(n=2),ML组(n=2),Bt-ML组(n=2);经耳缘静脉分别注射SPIO、ML及Bt-ML溶液100μmol/kg;2小时后行空气栓塞法处死动物,快速取其肝脏、脾脏、下领淋巴结、肺脏、肾脏及心脏组织,用4%福尔马林固定,常规石蜡包埋、切片,行普鲁士蓝染色,于正置显微镜下观察组织内的铁分布情况。2.3乳腺癌细胞整合素αvβ3受体表达的检测2.3.1流式细胞术检测不同乳腺癌细胞株αvβ3受体的表达强度将三种常见的乳腺癌细胞株MDA-MB-435S、MDA-MB-231及MCF-7制成单细胞悬液,然后将细胞放入EP管内与荧光FITC-抗体孵育,分别设立空白对照,之后将细胞放入流式细胞仪内进行分析。2.3.2细胞免疫化学检测细胞αvβ3受体的表达位置将乳腺癌细胞MDA-MB-435S接种于细胞爬片,4%多聚甲醛固定后,加入含0.3M甘氨酸封闭液封闭,再加入抗体与细胞在湿盒中孵育,4℃过夜;经DAPI复染后,封固液封固,封片后移至荧光显微镜下观察。2.4 细胞毒性实验(MTT法)以每孔4× 104个MDA-MB-435S或MCF7细胞接种于96孔培养板,37℃,5%C02条件下培养48 h后,弃去上清液,分别加入含有SPIO、ML及Bt-ML的DMEM全培溶液200μl,铁浓度分别为200、400、800、1200、1600及2000μM,每组设3个复孔。另外,以仅含培养基,不含细胞的作为调零孔;以仅含正常培养细胞的作为正常对照孔;以只加入上述纳米粒的为样品对照孔。培养20 h后,弃去上清液,用PBS洗两遍后,加入浓度为5 mg/ml的MTT,每孔50μl,于37 ℃、5%C02条件下继续孵化4 h后,吸取上清液,每孔加入150μl二甲基亚砜,于平板震荡仪上震荡10 min,于酶标仪在490 nm波长处测定OD值,比色时,以空白孔调零。计算细胞存活率,公式为:细胞存活率=(样品孔OD值-样品对照孔OD值)/正常对照孔OD值。3.荷乳腺癌SCID小鼠MR靶向增强成像实验及病理学检查3.1新型磁性脂质体三步预定位法靶向肿瘤新生血管整合素αvβ3受体的MR增强成像实验SPF级4周龄NOD/SCID雌性小鼠10只,体重18-22 g。制成MDA-MB-435S细胞悬液,以107个细胞/0.2 ml接种于小鼠右侧乳腺脂肪垫下,在SPF环境下饲养6-8周,肿瘤最大直径至0.8-1.2cm。三步预定位法成像方案:首先,经尾静脉注射生物素化抗整合素αvβ3单克隆抗体150 μg;36 h后,缓慢腹腔注射1 mg冷亲和素,10 min后,腹腔注射0.5 mg冷链霉亲和素;2 h后,经尾静脉注射含80μmolFe/kg的ML(n=5)或Bt-ML(n=5)。小鼠在麻醉状态下(腹腔注射戊巴比妥钠),分别于注射造影剂前及2 h后行MR扫描。扫描方法:使用鼠专用线圈,采用FSE-T2WI冠状位扫描。扫描数据经图像软件处理后,比较增强前后肿瘤区域的像素灰度值,计算并比较靶向组及非靶向组肿瘤区域内强化像素点的数量。1.2肿瘤组织病理学检查MR扫描结束后,离颈处死荷瘤小鼠,取肿瘤组织浸泡于4%多聚甲醛固定,4℃固定过夜。常规石蜡包埋,连续切片,行HE、普鲁士蓝染色及CD31+罗丹明双荧光免疫组化,并分析比较MR信号改变区与αvβ3表达位置及肿瘤新生血管的关系。结果1.SPIO及新型磁性靶向脂质体的理化性质检测1.1透射电镜下SPIO显示为类圆形、形态规则、大小均匀的黑色颗粒,仅有轻度团聚现象,平均粒径约为13.6 nm。新型被动、主动靶向磁性脂质体电镜下均显示为以Fe304颗粒为核心,外层由双层磷脂膜结构包裹的类球体,表面平滑光整,大小较均匀,平均粒径分别约为17.0和17.6 nm。1.2测定流体粒径,SPIO数均粒径为86.9 nm,多分散系数0.146;SPIO经脂质体包裹后,ML及Bt-ML粒径有所增加,其数均粒径分别为129.0 nm和120.0 nm,多分散系数分别为0.186和0.235,峰形尖而窄,分布较为均一。1.3原子吸收光谱法测定月桂酸稳定的SPIO的铁含量为22 mg/ml;新型被动、主动靶向脂质体纳米微粒溶液的铁含量分别为0.48和0.50 mg/ml。1.4 X线粉末衍射晶体结构分析月桂酸稳定的SPIO、ML和Bt-ML粉末的晶型与标准Fe3O4粉末的晶型一致,说明月桂酸修饰及脂质体包裹没有明显改变SPIO的晶型。XRD 衍射图谱在 2θ为 30.1°、35.5°、43.1°、53.4°、57.0°和 62.6°处均出现主要衍射峰,特征吸收峰强度(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(400),其位置与Fe3O4标准图谱中的位置一致,说明合成产物的主要成分为Fe3O4。1.5月桂酸稳定的SPIO、ML和Bt-ML的磁滞曲线均为过原点的单一曲线,即矫顽力非常小:当外加磁场为0时,没有剩磁;当有外加磁场存在时产生剩磁,说明具有超顺磁性,其质量饱和磁化强度分别为41.2、11.7和8.05 emu/g。1.6随着月桂酸稳定的SPIO、ML、Bt-ML溶液中铁浓度增加,T2横向弛豫时间缩短,造成T2信号减低,其T2弛豫率分别为0.722×106、0.611×106、0.675×106mol-1·s-1,高于SPIO T2弛豫率需0.062×106mol-1·s-1的最低标准。2.评价新型磁性靶向脂质体的细胞毒性及体内外逃逸巨噬细胞吞噬的特性;2.1巨噬细胞的体外吞噬实验:未加入含Fe溶液的空白对照组巨噬细胞几乎未见任何蓝染;ML及Bt-ML组仅见少量的巨噬细胞胞浆被染成浅蓝色;对照组(SPIO组)多数巨噬细胞的胞浆被染成深蓝色,体外吞噬实验证实SPIO经脂质体包裹并经PEG表面修饰后,可以显著减少巨噬细胞的非特异性吞噬。2.2家兔药物体内分布实验:普鲁士蓝染色示ML及Bt-ML组可见肝、脾及淋巴结内少量的蓝色铁染颗粒,其颜色较淡;心、肾、肺组织内则罕见蓝染颗粒;相反,SPIO组(对照组)内可见肝内大量蓝染颗粒沉积,其颜色明显较深,分布于肝Kuppfer细胞内,肝细胞内无蓝染颗粒分布;脾脏内也可见到大量蓝染铁颗粒;淋巴结、心、肾、肺组织内亦罕见蓝染颗粒。由此推断,ML及Bt-ML可以明显减少网状内皮系统吞噬,延长其循环时间,其结果与巨噬细胞的体外吞噬实验结果相一致。2.3乳腺癌细胞整合素αvβ3受体表达的检测:乳腺癌细胞株αvβ3受体表达强度依次为 MDA-MB-435SMDA-MB-231MCF-7,因而我们选择 MDA-MB-435S作为高表达成瘤细胞株,MCF-7作为阴性对照。细胞免疫化学检测MDA-MB-435S细胞αvβ3受体表达的位置主要位于细胞膜。2.4细胞毒性实验(MTT法):随着ML及Bt-ML培养液中铁浓度升高,MDA-MB-435S及MCF-7细胞存活率呈轻度下降的趋势。但是,ML及Bt-ML的细胞毒性很低,即使在高浓度(2000 μMFe)下,其细胞存活率也均在75%以上。3.荷乳腺癌SCID小鼠MR靶向增强成像实验及病理学检查3.1新型磁性脂质体三步预定位法靶向肿瘤新生血管整合素αvβ3受体的MR增强成像实验:靶向组注射Bt-ML后,可见肿瘤区域出现不均匀的信号减低,强化的像素点主要分布于肿瘤的周围区域,约占肿瘤区域面积的7.0±1.8%。非靶向组注射ML后,可见肿瘤区域出现较为均匀的轻度信号减低,其强化程度显著低于靶向组(t=5.226,P0.05),强化像素点亦主要分布于肿瘤的边缘区域,约占肿瘤区域面积的2.0± 1.1%。3.2肿瘤组织病理学检查:荧光免疫组化检查示靶向组内Bt-ML产生的红色荧光与肿瘤新生血管产生的绿色荧光形态较为一致,主要分布于肿瘤的周围区域,少数分布于中心区域;而非靶向组内ML产生的红色荧光散在分布于肿瘤新生血管腔外。普鲁士蓝染色可见靶向组铁分布于肿瘤新生血管基本一致,而非靶向组铁散在分布于肿瘤间质内。结论本研究制备出大小均一、性质稳定,具有超顺磁性及低毒性的新型磁性靶向脂质体,可以有效减少网状内皮系统吞噬,延长循环时间。利用抗体介导的三步预定位法,通过生物素-亲和素生物信号放大系统,可以主动靶向荷瘤乳腺癌新生血管内皮的整合素αvβ3受体,提高MRI对微小乳腺癌诊断的特异性及敏感性。第二部分:基于IVIM的MR扩散加权成像在肺部侵袭性真菌感染疗效预测中的应用目的探讨基于体素内不相干运动(IVIM)DWMRI技术在预测肺部侵袭性真菌感染(IFI)抗真菌治疗疗效中的应用。材料与方法本研究经过南方医院伦理委员会批准,所有受试者均书面签署知情同意书。选择根据EORTC/MSG诊断标准怀疑为肺部IFI的患者46例,平均年龄33.9± 13.0岁。所有患者均行3.0 TMR常规序列及多b值DWI扫描,选择11个b值(0-1000 sec/mm2)。使用双指数模型计算假性扩散系数D*、灌注分数f、真性扩散系数D,使用单指数模型计算表观扩散系数(ADCtotal)。使用组内相关系数(ICC)计算观察者间测量一致性。根据抗真菌感染疗效将患者分为疗效较好组(FR组,n=32)和疗效较差组(UR组,n=14)。两组间IVIM参数值D值、D*值及f值的比较采用非参数Mann-Whitney检验法,ADCtotal值的比较采用两独立样本t检验法。使用ROC曲线评估IVIM所得参数对疗效的预测效能。结果FR组的DWI信号强度衰减曲线符合双指数模型,而UR组信号衰减曲线较符合单指数模型。所有患者的D值均低于ADCtotal。两名观察者间测量一致性很好(ICC 0.954-0.988,P0.001)。UR组(12.6%± 4.4%)的f值显著低于FR组(30.2%±8.6%),两组间差异具有统计学意义(Z=4.989,P0.001)。但两组间ADCtotal、D和D*的差异无统计学意义(P0.05)。根据ROC曲线分析表明,f植的阈值为18.6%时(AUC=0.967),预测效能最佳,敏感度和特异度分别为93.8%和92.9%。结论IVIM-MRI成像技术可以对肺部IFI的抗真菌治疗疗效进行预测,灌注分数f低于18.6%可能是早期预测疗效较差的影像学指标。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9;R445.2

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