EIF3C在人脑胶质瘤中的表达及其对脑胶质瘤U87MG细胞增殖作用的体内外研究

发布时间：2018-05-10 12:37

本文选题：脑胶质瘤 + 真核翻译起始因子3亚基c　；参考：《河北医科大学》2015年博士论文

【摘要】：脑胶质瘤是最常见、难以控制和最致命的人类颅内肿瘤,占原发性中枢神经系统肿瘤的40%以上。根据世界卫生组织的神经病理学分类,脑胶质瘤被分为星形细胞瘤、少突星形细胞瘤、室管膜细胞瘤、髓母细胞瘤、多形胶质母细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤和脉络丛乳头状瘤等。世界卫生组织根据脑胶质瘤的恶性程度将其分为I级、II级、III级和IV级四个级别。I级脑胶质瘤在生物学上是良性肿瘤,完全切除能够治愈;II级脑胶质瘤属于低度恶性,可能经历较长的临床过程,但早期弥漫浸润到临近的脑组织中导致即使手术也会因术后复发而不能治愈;III级脑胶质瘤比II级胶质瘤呈现出更多的间变和恶性增殖的特征,常常进展快而致命;IV级脑胶质瘤性质更加恶劣,他们对化疗和放疗都不敏感,往往生存时间更短。程度最高的星形细胞瘤被称为多形胶质母细胞瘤或简称为GMB,属于脑胶质瘤IV级。在成年人,恶脑脑胶质瘤(III级和IV级)占所有原发性脑肿瘤的比例接近60%。恶性脑胶质瘤,尤其多形胶质母细胞瘤,对化疗和放疗反应差、术后复发率高,是最难治疗的肿瘤。尽管近年来显微手术、放疗和化疗等治疗措施获得较大进展,但恶性脑胶质瘤患者平均生存时间仍然是9~12个月,很少病人能获得治愈。据报道,除了属于I级的毛细胞型星形细胞瘤之外,罹患其它类型脑胶质瘤病人自诊断后5年生存率不足3%。脑胶质瘤病人的预后仍然非常差,近些年也没有明显的变化。而且,有报道老年病人比年轻成年病人的相对风险高出3.18倍。无论是低级别还是高级别,脑胶质瘤均呈现浸润性生长和富有血管的特性。肿瘤细胞浸润临近的脑组织,常常导致常规治疗手段的失败。如今,许多化疗药物被发现产生较为严重的副作用,因此也影响肿瘤治疗的效果。大约有30%的病人由于现代药物严重的副作用而放弃化疗。为此,人们已经进行了很多努力和尝试,通过开展新的治疗方法和发现新的药物作用机制来提高药物的治疗效果,减少药物的毒副作用。目前,尽管一些药物用于脑胶质瘤的临床治疗,但存在着我们如何提高治疗效果、减少并发症和降低复发率等许多挑战。分子遗传学研究人员已经证实基因变化参与了恶性肿瘤的发生和进展,包括杂合子10(LOH10)、磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)、肿瘤蛋白p53(TP53)、表皮生长因子(EGFR)和p16的丢失等等。人们认为肿瘤的发生和进展同多种基因改变和基因表达模式改变的累积有关。掌握脑胶质瘤发生和进展基因改变的分子通路,将有希望在不远的将来获得新的有效的治疗靶点,这将有助于提高脑胶质瘤患者的生存状况,并改善他们的医疗预后。蛋白质翻译异常在人类肿瘤中广泛存在。近年来,人们发现真核翻译起始因子(e IFs)在多种人类肿瘤发生和进展中发挥着重要作用。然而,真核翻译起始因子在脑胶质瘤中的作用和机制仍然不清楚,还需要进一步研究阐明。本研究探讨了真核翻译起始因子3(e IF3)的核心亚基e IF3c在人脑胶质瘤中的作用。首先,采用免疫组织化学SP技术和RT-PCR技术检测了e IF3c在人脑胶质瘤和正常脑组织中的表达。然后,利用慢病毒介导si RNA的方法,在体外实验中探讨了e IF3c基因沉默对U87 MG细胞的增殖、凋亡、细胞周期和克隆形成等的影响。随后,又建立了胶质瘤裸鼠移植模型,在体内实验中观察了e IF3c基因沉默对脑胶质瘤形成和增殖生长的影响。根据以上的实验结果,证实了e IF3c在脑胶质瘤的形成和进展中起着重要作用,以期在临床实践中为脑胶质瘤的基因治疗奠定极为重要的理论基础。本课题研究内容包括以下三部分:第一部分EIF3C在人脑胶质瘤和正常脑组织中的表达研究目的:采用免疫组织化学SP方法和逆转录聚合酶链式反应技术,检测e IF3c在人脑胶质瘤和正常脑组织标本中的表达情况,探讨e IF3c在脑胶质瘤中的表达与脑胶质瘤的病理级别、肿瘤大小、位置、病人年龄和性别等临床特性的相关性。方法：1病人的临床资料和肿瘤标本的处置脑胶质瘤标本来自河北医科大学第二医院神经外科2008年1月-2013年12月期间接收外科手术的83例脑胶质瘤患者。另外对照组27例正常脑组织标本来自同期27例颅脑损伤行内减压手术的患者。所有标本均经两名以上神经病理医师明确诊断。所有患者术前均未接受放疗、化疗和免疫治疗。83例脑胶质瘤患者中,男性44例,女性39例,平均年龄为44.54±12.53岁(年龄范围16岁到73岁)。所有组织标本取材后均分为两部分:一部分标本速冻并储存在-80℃液氮中以备抽取目的基因e IF3c的m RNA;另一部分标本经10%福尔马林固定,石蜡包埋,应用免疫组织化学SP法检测e IF3c的表达。详细记录所有标本的病人年龄、性别、肿瘤大小、生长部位和病理级别等临床资料。在液氮中保存的标本中,取其中的31例脑胶质瘤标本和5例正常脑组织标本进行RT-PCR实验,用于检测内源基因e IF3c的表达。2采用IHC方法检测脑胶质瘤和正常脑组织中e IF3c蛋白的表达脑胶质瘤和正常脑组织标本中e IF3c蛋白的表达采用免疫组化染色进行检测。将石蜡块切成4μm厚度放在玻璃载片上。二甲苯脱蜡,切片在乙醇梯度溶液下复水;将切片浸入0.01mmol/L柠檬酸钠缓冲液中,抗原微波修复30分钟,切片10%牛血清蛋白封闭,滴加兔抗人单克隆抗体e IF3c抗体孵化过夜,滴加抗山羊二抗60分钟,之后切片DAB显色,苏木素复染。在显微镜下获取数字图像。3 e IF3c蛋白的表达同临床特征之间的关系分析分析e IF3c蛋白的表达同脑胶质瘤患者的年龄、性别以及肿瘤病理级别、大小、位置的关系。4 Real-time PCR检测脑胶质瘤及正常脑组织中e IF3c的表达提取液氮保存的31例脑胶质瘤组织及5例正常脑组织标本中的总RNA,并反转录成c DNA,采用real-time PCR方法检测内源基因e IF3c的表达情况。数据应用Graph Pad Prism 4.0软件进行分析,并应用2-ΔΔCT法测定基因表达的相对量。结果：1 e IF3c蛋白在人脑胶质瘤组织中过度表达e IF3c蛋白主要定位于细胞质,高倍镜下在细胞质出现棕黄色颗粒或弥漫黄色者为阳性细胞。83脑胶质瘤标本中,e IF3c蛋白呈阳性表达有69例,呈阴性表达为14例,阳性表达率为83.13%(69/83)。而在27例正常脑组织中e IF3c蛋白仅1例呈微弱表达,其余26例呈阴性表达,阳性表达率仅为3.7%(1/27)。e IF3c蛋白在脑胶质瘤中的表达阳性率明显高于正常脑组织(χ2=57.02,P0.0001)。e IF3c蛋白在人脑胶质瘤组织中存在过度表达。2 e IF3c蛋白在脑胶质瘤中的表达与临床特征之间的关系e IF3c蛋白在高级别脑胶质瘤(WHO III级和WHO IV级)中的表达阳性率为91.07%(51/56),而低级别脑胶质瘤(WHO I级和WHO II级)表达阳性率为66.67%(18/27),两者比较差异具有统计学意义(χ2=6.0950,P=0.01360.05);而e IF3c蛋白在脑胶质瘤中表达的阳性率与患者的年龄、性别及肿瘤生长的部位、大小均无统计学意义(均P0.05)。结果表明e IF3c阳性表达率同脑胶质瘤的级别相关。3 e IF3c基因m RNA在脑胶质瘤中存在高表达采用real-time PCR方法,检测液氮保存的31例脑胶质瘤标本和5例正常脑组织标本中e IF3c基因m RNA的表达水平。结果显示e IF3c基因m RNA在脑胶质瘤组织中的表达水平明显高于在正常脑组织中的表达水平(P0.01)。但是,e IF3c基因m RNA表达水平同脑胶质瘤的病理级别无关(P0.05)。4脑胶质瘤和正常脑组织中e IF3c基因调节的倍数变化31个脑胶质瘤样本中有30个样本相比正常脑组织样本中的e IF3c基因表达上调,上调倍数平均值为2.6倍。可以选择该基因e IF3c开展genecard实验。结论：1 e IF3c蛋白在人脑胶质瘤中过度表达。2 e IF3c高表达和脑胶质瘤的恶性表型有关,而与患者年龄、性别和胶质瘤生长部位和大小无关。3 e IF3c m RNA在脑胶质瘤中存在过度表达,但同脑胶质瘤的病理级别无关。4 e IF3c基因在脑胶质瘤中的表达上调。第二部分EIF3C对脑胶质瘤U87 MG细胞增殖作用的体外研究目的:利用RNA干扰技术进行一系列细胞学功能实验,探讨e IF3c基因对人脑胶质瘤U87MG细胞的增殖、凋亡、细胞周期和克隆形成的影响,明确e IF3c在人脑胶质瘤形成和进展中的作用。方法：1脑胶质瘤细胞株培养人胶质瘤细胞株(U87、U251、A172、U373)购自上海国家实验细胞资源共享平台,细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养。DMEM培养液中含有2左旋谷氨酰胺、青霉素(100 units/ml)和链霉素(100μg/ml),所有细胞株均在37℃、5%CO2条件下培养。2半定量RT-PCR检测e IF3c在脑胶质瘤细胞株中的表达从四种脑胶质瘤细胞株(U87、U251、A172、U373)中抽提总RNA,采用半定量RT-PCR方法检测e IF3c基因m RNA表达水平,确认e IF3c在脑胶质瘤细胞株中存在表达。3 e IF3c RNA干扰慢病毒载体的构建和转染e IF3c-si RNA序列为5’-GACCATCCGTAATGCCATGAA-3’,scrambled si RNA序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。这些核苷酸序列合成并通过表达si RNA的载体p GCSIL-GFP和包装e IF3c-si RNA的慢病毒插入质粒。建立稳定转染慢病毒的U87 MG和237T细胞系。4 q PCR检测m RNA水平e IF3c敲减效率U87细胞按照组别感染慢病毒表达质粒。感染3天后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况,感染5天后收集细胞。然后,采用RT-PCR方法检测e IF3c的m RNA敲减效率。5蛋白质印迹分析为离析蛋白质,细胞用RIPA缓冲液收集。应用SDS-PAGE将蛋白分离,再将蛋白转移到PVDF膜上,用一抗、二抗孵育,采用ECL试剂盒进行检测。X线显影获得显示条带的胶片。6采用Brd U方法测定U87MG细胞增殖实验增殖细胞的DNA合成用Brd U方法进行测定。U87 MG细胞转染表达e IF3c-si RNA或scr-si RNA的慢病毒,培养48小时,悬浮并以合适的浓度在96孔板上接种,5%CO2、37?C的培养箱内培养1-4天。加入稀释的溴脱氧尿苷(Brd U)后的第1天和第4天收集细胞,用酶标仪在450nm波长下测定其吸光度(OD),Brd U信号和细胞增殖根据吸光值进行分析。7细胞周期检测U87MG细胞转染表达e IF3c-si RNA或scr-si RNA的慢病毒,在37℃条件下培养96小时。细胞重悬,接种在6cm的培养盘中。细胞长到80%方法:融合率时被收集固定,PBS洗涤,含有PI、RNase、PBS进行染色。最后,应用流式细胞技术测定细胞周期。8细胞克隆形成实验U87MG细胞转染表达e IF3c-si RNA或scr-si RNA的慢病毒,培养5天后收集、悬浮并种植在6孔培养皿中。培养2周后,细胞用4%多聚甲醛固定,稀释的Giemsa染料染色20分钟,蒸馏水漂洗干净,在荧光显微镜下计数超过50个细胞的克隆。9细胞凋亡实验使用Annexin V-APC染色、流式细胞仪检测细胞凋亡。U87MG细胞转染表达e IF3c-si RNA或scr-si RNA的慢病毒,培养5天,收集并用PBS洗涤,用含有5μl Annexin V-APC的缓冲液重悬细胞沉淀,室温避光10-15分钟。使用流式细胞仪检测细胞。结果：1 e IF3c在脑胶质瘤细胞株中的表达半定量RT-PCR检测胶质瘤细胞株U87、U251、A172、U373结果显示,e IF3c基因的m RNA在4种脑胶质瘤细胞株中均存在表达。2构建表达e IF3c-si RNA或scrambled si RNA的慢病毒载体成功构建了表达e IF3c-si RNA或scrambled si RNA的慢病毒载体,并实现其在U87MG细胞的稳定高表达。3慢病毒介导的si RNA能有效抑制胶质瘤细胞系e IF3c基因的表达应用荧光定量PCR方法检测e IF3c m RNA水平。沉默e IF3c基因导致e IF3c m RNA表达下降95%。结果表明利用慢病毒介导的RNAi技术能够高效敲减e IF3c基因在m RNA水平的表达。4沉默e IF3c基因后293T细胞e IF3c蛋白水平明显降低蛋白水平用免疫印迹方法检测。同阴性对照组相比,应用RNA干扰技术e IF3c基因沉默后,293T细胞的e IF3c蛋白明显下降。GAPDH作为内参对照。5敲减e IF3c能有效抑制U87MG细胞的增殖细胞计数结果显示感染24小时后,e IF3c-si RNA组U87MG细胞增殖明显受到抑制,之后4天e IF3c敲减对U87MG细胞增殖的抑制作用更加明显。Brd U法检测结果显示e IF3c-RNAi组U87MG细胞Brd U值明显减少,e IF3c-RNAi组和Scr-RNAi组比较具有显著性差异(P0.05)。结果表明敲减e IF3c基因表达能显著抑制U87MG细胞的增殖。6敲减e IF3c基因表达抑制U87MG细胞克隆形成克隆形成试验显示Scr-si RNA对照组U87MG细胞形成克隆数目平均为23个,而e IF3c-si RNA实验组仅为15个,相比减少34.8%,他们之间有显著性差异(P0.05)。结果提示e IF3c基因与U87MG细胞的克隆形成能力密切相关。7 e IF3c敲减导致U87MG细胞周期停止细胞周期分布显示,e IF3c敲减显著导致U87MG细胞在G0/G1期停止,在S期细胞比例相应减少。e IF3c-si RNA组在G0/G1期的细胞比例增加了71.42%和79.05%,而在S期的比例下降了17.09%和7.83%。e IF3c-si RNA组和Scr-si RNA组比较有显著性差异(P0.05)。因此,敲减e IF3c基因表达抑制了从G1期到S期的过渡。8 e IF3c敲减促进U87MG细胞凋亡利用Annexin V-APC检测细胞凋亡显示实验组e IF3c-si RNA U87MG细胞凋亡率为5.83%,而对照组Scr-si RNA U87MG细胞凋亡率只有2.78%,两者比较有显著性差异(P0.01)。结果表明e IF3c基因敲减可能诱导U87MG细胞凋亡。结论：1采用半定量PCR技术,e IF3c基因在脑胶质瘤细胞株(U87、U251、A172、U373)中存在表达。2通过RNAi技术,下调慢病毒介导的U87MG细胞中的e IF3c基因表达水平,能显著抑制U87MG细胞的增殖,促进他们的凋亡。3 e IF3c基因表达敲减诱导U87MG细胞G0/G1期阻止,抑制G1到S期的转换。e IF3c基因调控细胞周期分布的作用可能是影响U87MG细胞增殖和凋亡的机制之一。4下调e IF3c基因的表达可以明显抑制U87MG细胞的增殖,e IF3c基因可以作为脑胶质瘤治疗新的靶点。第三部分EIF3C对脑胶质瘤U87MG细胞增殖作用的体内研究目的:建立人脑胶质瘤细胞系U87MG裸小鼠皮下荷瘤模型,并对其生物学特性进行研究,进一步验证体外实验发现的结果。方法：1实验动物分组无胸腺裸鼠共24只,随机分为Negative control、Scrambled和e IF3c-si RNA三组,并分别处理。2人脑胶质瘤U87MG细胞培养U87MG细胞体外培养并制备细胞悬液。3脑胶质瘤裸鼠荷瘤移植模型的建立无胸腺裸鼠皮下注射处理过或没有处理过的U87MG细胞。Negative control组小鼠皮下注射没有感染的U87MG细胞;Scramble组小鼠注scrambled si RNA U87MG细胞;e IF3c-si RNA组小鼠注射e IF3c-si RNA U87MG细胞。4肿瘤体积和重量的测定从裸鼠注射U87MG细胞第10天开始,肿瘤的直径每隔一天记录一次,共18天。裸鼠喂养28天观察期结束,将其处死,切除皮下肿瘤制作标本,分别称重。结果：1脑胶质瘤裸鼠移植模型建立脑胶质瘤U87MG裸鼠移植模型成功建立,并进行体内实验。2体内实验e IF3c敲减能抑制肿瘤的生长在最初的11天里,三组之间肿瘤体积测量无显著差异。然而在第13天后,e IF3c-si RNA组肿瘤生长明显受到抑制。观察期结束,e IF3c-si RNA组肿瘤平均体积比Scr-si RNA组和Control组明显减少(P0.01)。3体内实验e IF3c敲减能减少肿瘤的重量观察期结束,裸鼠处死,瘤体从裸鼠皮下切除并称重,e IF3c-si RNA组瘤体的重量比Scr-si RNA组和Control组也显著降低(P0.01)。结论：1在体内实验e IF3c敲减能显著抑制U87 MG细胞增殖和肿瘤增长。2 e IF3c基因可以作为人类脑胶质瘤新的治疗靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.4

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