IFN-γ诱导肿瘤再生细胞休眠模型的建立及其机制初探

发布时间：2018-05-10 23:28

本文选题：免疫监视 + 肿瘤再生细胞　；参考：《北京协和医学院》2017年硕士论文

【摘要】：恶性肿瘤是现代社会人类常见的死亡原因之一,研究肿瘤的生物学特性对于攻克肿瘤有着重要的意义。2011年Weinberg提出恶性了肿瘤10大特征,在原有的6个特征的基础上,新增了避免免疫摧毁、促进肿瘤相关炎症、细胞能量代谢异常和基因组不稳定和突变4大特征。其中避免免疫摧毁是恶性肿瘤和免疫系统不断博弈的结果,也是肿瘤生物治疗的核心。肿瘤和免疫系统的之间关系错综复杂,1970年Burnet提出了“肿瘤免疫监视”假说,2002年Schreiber等人又在此基础上不断完善,提出了“肿瘤免疫编辑学说”。肿瘤免疫编辑学说更加全面准确的阐述了肿瘤和免疫系统的相互作用,将整个肿瘤免疫监视的过程分为3个主要阶段:清除阶段、平衡阶段和逃逸阶段。其中平衡阶段是3个阶段中最关键的部分,与后续的肿瘤复发有着直接的关系,在平衡阶段,免疫系统有可能将肿瘤细胞限制在休眠状态。肿瘤休眠是一个临床概念,主要是指经过手术治疗的肿瘤患者,残余的肿瘤细胞在体内长期存在而又没有明显生长的一种状态。肿瘤休眠是肿瘤发生发展过程中的重要组成部分,也是肿瘤复发的根本原因,因此将休眠的肿瘤细胞成为“恶魔的种子”。虽然这一概念已经提出很长时间,但是其机制却不清楚,原因可能在于:研究模型比较匮乏,至今为止没有很理想的肿瘤休眠模型去模拟这一临床行为;而且由于肿瘤的异质性的存在,使得研究必须要深入到肿瘤细胞群体的各个亚群;再者免疫系统中发挥作用的免疫细胞及细胞因子更是错综复杂,大大提高了研究的难度。本研究采用体外共培养肿瘤特异性CTL和肿瘤细胞,观察CTL对不同亚群肿瘤细胞的作用效果,发现了特异性CTL不能杀伤TRCs,但是可诱导TRCs进入休眠。在此基础上筛选出了 IFN-γ这一细胞因子,以IFN-γ为切入点,建立了体内体外肿瘤休眠的模型,在一个新的层次证明了肿瘤免疫监视的存在,具有重要的免疫学和生物学价值。本课题的研究内容主要包括三个部分:(1)IFN-γ体外诱导肿瘤再生细胞休眠;(2)IFN-γ体内诱导肿瘤再生细胞休眠;(3)IFN-γ诱导肿瘤再生细胞休眠机制初探。目的:IFN-γ诱导肿瘤再生细胞休眠模型的建立及机制初探方法:取共培养上清(CM)、PBS培养TRCs,比较TRCs克隆数目、大小的变化,FCM分析CM对TRCs的杀伤以及对TRCs细胞周期的影响;利用ELISA检测CM中各种因子的含量,使用中和抗体筛选导致TRCs的增殖受到影响的细胞因子;小鼠皮下接种OVA-B16黑色素瘤TRCs,FCM分析不同组瘤块内OVA-B16黑色素瘤TRCs细胞的细胞周期;5d、10d分别取相应位置小鼠皮肤进行免疫组化、HE染色,统计肿瘤大小;体外3D纤维蛋白软凝胶培养B16 TRCs,接种至小鼠皮下,构建小鼠荷瘤模型,待肿瘤长至5 X 5mm时,给予小鼠皮下注射IFN-γ,取瘤组织固定切片,WB、Confocal分析IDO1、AhR蛋白表达水平及表达变化;取肿瘤组织,将细胞进行3D纤维蛋白软凝胶培养,5d后,统计各组克隆形成数目;联用IFN-γ以及IDO信号通路的抑制剂,分析肿瘤组织中TRCs的比例以及细胞周期水平变化。长时间联用IFN-γ以及IDO信号通路的抑制剂(1MT/DMF)治疗荷瘤小鼠,观察小鼠肿瘤生长情况以及生存期变化。结果:1.经过CM培养后的TRCs在2d和4d克隆体积大小比较没有统计学差异(P0.05),且与PBS组培养后的TRCs相比,克隆数目比较没有统计学差异(P0.05),但是CM培养的TRCs克隆体积远远小于PBS组培养的TRCs,两组间比价具有统计学差异(P0.01)。FCM细胞周期分析显示,相对PBS组(G0/G1:47.21%),CM组TRCs处于G0/G1期的比例提高至77.98%,两组间比较具有统计学差异(P0.01)。2.ELISA 检测 CM 显示上清中存在 IFN-γ(680.25 pg/mL)、TNF-a(170.40 pg/mL)、IL-2(15 pg/mL)、IL-10(32 pg/mL)。而使用 IFN-γ 中和抗体后,FCM分析,OT-I CTL对OVA-B16黑色素瘤细胞的杀伤明显降低,由30.62%下降至12.88%,两组间数据比较具有统计学差异(P0.01),而对OVA-B16黑色素瘤TRCs的杀伤两组数据比较无统计学差异(P0.05)。FCM细胞周期分析显示,相对CM组(G0/G1:77.65%),anti-IFN-γ 组 TRCs 处于 G0/G1 期的比例下降至 52.81%,两组间数据比较具有统计学差异(P0.01)。3.FCM分析显示相对于PBS组(G0/G1:30.12%),CTL组处理后瘤块内OVA-B16黑色素瘤TRCs的G0/G1期上升至76.53%,两组间数据比较具有统计学差异(P0.01);相对于 CTL 组(G0/G1:75.98%),anti-IFN-γ/CTL 组处理后瘤块内OVA-B16黑色素瘤TRCs的G0/G1期下降至51.94%,两组间数据比较具有统计学差异(P0.01);相对于PBS组(G0/G1:17.20%),IFN-γ组处理后瘤块内B16黑色素瘤TRCs的G0/G1期上升至66.80%,两组间数据比较具有统计学差异(P0.01)。4.免疫组化、HE染色显示PBS组肿瘤大小20d明显大于5d,两组间数据比较具有统计学差异(P0.01);而IFN-γ组肿瘤大小20d与5d变化不明显,两组间数据比较没有统计学差异(P0.05);IFN-γ组肿瘤大小10d与5d变化不明显,两组间数据比较没有统计学差异(P0.05),而IFN-γ/anti-IFN-γ组肿瘤大小l0d明显大于5d,两组间数据比较具有统计学差异(P0.01)。5.Confocal、Western Blot 结果显示,经过 IFN-γ处理之后,Confocal、Western Blot检测得IDO1水平明显上调,AhR明显入核;与正常组相比,IFN-γ组的TRCs克隆形成数目无明显变化(P0.05),联用IFN-γ以及IDO信号通路的抑制剂(1MT、DMF)组的TRCs克隆形成数目明显减少(P0.01);FCM分析显示,与正常组相比,IFN-γ组细胞大多数(34%)处于G0/G1期,而联用IFN-γ以及IDO信号通路的抑制剂(1MT、DMF)后,大多数TRCs处于sub-GO期。各组之间相比具有统计学差异(P0.01);动物实验结果显示,长时间联用IFN-γ以及IDO信号通路的抑制剂(1MT/DMF)治疗荷瘤小鼠,可以明显减小肿瘤体积、延长荷瘤小鼠生存期,各组间数据比较具有统计学差异(P0.01)。小结:肿瘤特异性OT-ICTL可以明显杀伤OVA-B16黑色素瘤细胞,但是总有一部分细胞不能被杀伤,而这群没有被杀伤的细胞经证实即为TRCs。虽然CTL不能杀伤TRCs,但是CTL可以分泌大量的IFN-γ,利用IFN-γ将TRCs诱导至休眠状态。体外结果进一步证实,IFN-γ的确能够诱导TRCs进入休眠状态,使得TRCs的克隆大小维持不变、细胞周期阻滞在G0/G1期。肿瘤特异性OT-I CTL在体内也可以将OVA-B16黑色素瘤TRCs诱导至休眠,这一作用可以被anti-IFN-γ所阻断,说明CTL是通过INF-γ来诱导TRCs进入休眠的,进一步的体内实验证实,INF-γ的确也可以诱导TRCs至休眠状态。IFN-γ可以显著上调TRCs的IDO1表达,通过上调IDO1,诱导AhR入核使得TRCs进入休眠状态,而联用IFN-γ以及IDO信号通路的抑制剂(1MT/DMF)治疗荷瘤小鼠,可以明显减小肿瘤体积、延长荷瘤小鼠生存期。
[Abstract]:Tumor dormancy is one of the most important parts of tumor and immune system . The effects of CM on TRCs and cell cycle were analyzed by means of ELISA . The results were as follows : 1 . The volume of TRCs was increased to 77.98 % in mice . IL - 10 ( 32 pg / mL ) . Compared with the control group ( G0 / G1 : 77.65 % ) , there was no significant difference between the two groups ( P0.01 ) . Compared with the group of CTL ( G0 / G1 : 77.65 % ) , there was no significant difference between the two groups ( P0.01 ) . The results showed that IFN - 纬 could induce TRCs to enter dormant state . The results showed that IFN - 纬 could induce TRCs to enter dormant state .

【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.3

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