Rb蛋白调控mTORC2的机制研究

发布时间：2018-05-13 00:00

  本文选题：视网膜母细胞瘤蛋白(Rb) + 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)　； 参考：《华中科技大学》2015年博士论文

【摘要】：目的:研究肿瘤抑制蛋白Rb抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2 (the mechanistic target of rapamycin complex 2,mTORC2 )的机制及方式 。方法:通过免疫印迹法(WesternBlot)检测Rb基因的敲除小鼠胚胎纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs),多种肿瘤细胞的Rb shRNA稳定株和肿瘤细胞tet-on Rb过表达稳定株的mTOR通路蛋白水平及其磷酸化水平,证实Rb抑制mTORC2活性。通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitate,Co-IP), GST 沉降(GSTpull down),凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)等方法证实Sin1为Rb的作用蛋白。将全长Sin1载体通过分子克隆片段化为N、CRIM、RBD和PH四个结构域,证实PH结构域为Rb作用的靶点。结果:与Rbloxp/loxpMEFs相比,Rb-/-MEFs显示出增加的Akt Ser 473的磷酸化水平,提示其mTORC2功能增加,而反映mTORC1功能的S6K Thr389磷酸化水平未见明显变化,提示Rb特异性抑制mTORC2功能。肿瘤细胞宫颈癌细胞系HeLa,卵巢癌细胞系OVCAR5和乳腺癌细胞系MDA-MB-231 Rb shRNA稳定细胞株中进一步确认Rb特异性抑制mTORC2活性,而不影响mTORC1活性。在pTRIPZ-HA-Rb OVCAR5细胞株中,加入强力霉素(doxycycline)诱导Rb的表达,发现Rb表达水平的增加伴有Akt Ser473的磷酸化水平的下降。过表达Rb进行Co-IP以及全内源Co-IP提示Sin1为mTORC2复合物中唯一与Rb结合的蛋白,且Sin1-PH结构域为Rb作用的靶点。结论:Rb通过结合Sin1-PH结构域特异性抑制mTORC2活性,而不影响mTORC1活性。
[Abstract]:Aim: to study the mechanism and mechanism of tumor suppressor protein RB in inhibiting mammalian rapamycin target protein complex 2 and the mechanistic target of rapamycin complex 2 mTORC2. Methods: Western blot was used to detect the level of mTOR pathway protein and phosphorylation of RB gene knockout mouse embryonic fibroblast MEF, RB shRNA stable cell and tet-on RB overexpression stable strain. It was confirmed that RB inhibited mTORC2 activity. The co-immunoprecipitate co-IPP, GST sedimentation and GST pull downdown, gel filtration chromatography gel filtration chromatography-were used to confirm that Sin1 is a RB acting protein. The full-length Sin1 vector was transformed into four domains by molecular cloning. It was confirmed that the PH domain was the target of RB action. Results: compared with Rbloxp/loxpMEFs, Rb-P / -MEFs showed an increased phosphorylation level of Akt Ser 473, indicating an increase in mTORC2 function, but no significant change in S6K Thr389 phosphorylation level reflecting mTORC1 function, suggesting that RB specifically inhibited mTORC2 function. In tumor cell line HeLa, ovarian cancer cell line OVCAR5 and breast cancer cell line MDA-MB-231 RB shRNA stable cell line, it was further confirmed that RB specifically inhibited mTORC2 activity, but did not affect mTORC1 activity. The expression of RB was induced by adding doxycycline (doxycycline) to pTRIPZ-HA-Rb OVCAR5 cell line. It was found that the increase of RB expression was accompanied by the decrease of phosphorylation of Akt Ser473. Overexpression of RB for Co-IP and total endogenous Co-IP suggest that Sin1 is the only protein binding to RB in mTORC2 complexes and Sin1-PH domain is the target of RB binding. ConclusionThe specific inhibition of mTORC2 activity by binding to Sin1-PH domain does not affect the activity of mTORC1.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.91

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