新型光敏剂HCE 6介导光动力治疗胆管癌的实验研究

发布时间：2018-05-13 15:22

本文选题：胆管癌 + 光动力　；参考：《第二军医大学》2016年硕士论文

【摘要】：研究背景和目的胆管癌(CC)是仅次于原发性肝癌的肝胆原发性恶性肿瘤,也是胆道系统最常见的恶性肿瘤。它起源于肝内外胆管上皮细胞,约占所有消化系统肿瘤的3%左右。在过去几年,内镜技术逐渐提高,人们对胆管癌的了解也越来越多,全世界该病的发病率和死亡率在逐年上升。胆管癌的预后非常差,死亡率很高。胆管癌最常见的危险因素包括原发性硬化性胆管炎(伴有或不伴有溃疡性结肠炎)、肝硬化以及乙肝、丙肝等病毒性肝炎。而胆管癌最常见的临床表现就是胆道梗阻,例如梗阻性黄疸,白陶土色大便,橘黄色小便,皮肤瘙痒等等。外科手术切除是胆管癌的唯一根治性治疗方法。但是由于诊断方法(CT,MRI,血液学检测)的不足,大部分胆管癌患者在诊断时已处于晚期阶段。大约超过70%的胆管癌患者在诊断时已经处于无法手术切除阶段。同时手术治疗还伴有较高的并发症发生率和较高的复发率。因此,应用其他姑息性治疗方法缓解胆管癌的胆道梗阻症状对病人来说具有重要的意义,尤其是对于无法手术切除的胆管癌患者。内镜支架置入术作为一种被广泛接受的姑息性治疗方法,能有效地改善无法手术切除的胆管癌患者胆道梗阻症状,提高患者的生存质量。而金属支架相比塑料支架拥有更长的支架通畅期。但是胆道支架置入同时也伴有支架再次梗阻的问题,也无法延长胆管癌患者的生存期。而胆管癌对其他传统治疗方法(如放疗、化疗)也不敏感。因此寻找新型的胆管癌治疗方法目前具有重要的临床意义。光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)作为一种新型微创治疗方法,目前已经广泛应用于膀胱癌、食管癌、前列腺癌、头颈部肿瘤等多种实体肿瘤的治疗,并取得了显著的治疗效果。PDT主要包括三个基本要素:光敏剂、激光、氧。大量体内、体外和临床研究已经证实PDT对于缓解无法手术切除的胆管癌患者的胆道梗阻、提高患者生存质量和延长患者生存期具有显著的效果。但是PDT同样伴有一定的副作用:严重的光毒性和较长的治疗后避光时间,为了避免PDT这些不足之处,研发高效能和低毒性的新型光敏剂对于PDT治疗胆管癌领域具有重要的意义。因此本实验的研究目的就是评估一种新型光敏剂HCE6对胆管癌的治疗作用,并探讨相关的作用机制。研究方法用含有10%胎牛血清的DMEM培养基体外培养胆管癌细胞系FRH-0201和QBC-939。取对数期生长的细胞接种于96孔板中,接种数为1′104/孔。培养24h后分别以不同浓度的HCE6(0,0.5,1,2,4,8 ug/ml)孵育24h,以不同激光强度(2.5,5,10,15 J/cm2)的波长为652nm的激光照射。照射完后继续避光培养24h,CCK8方法检测细胞增殖率和增殖抑制率,探讨HCE6介导的PDT的药物浓度-疗效、光照强度-疗效关系。为了探讨HCE6孵育时间对PDT作用结果的影响,我们分别将FRH-0201细胞以HCE6处理3h、6h、12h、24h,然后以10J/cm2的激光照射,同样以CCK8法检测各组细胞增殖抑制率,评估最佳药物作用时间。为了比较HCE6与传统光敏剂喜泊分(HiPorfin)和Photofrin的PDT效果,我们将接种的细胞分为三组:HCE6介导PDT组;HiPorfin介导PDT组;Photofrin介导PDT组。各组细胞分别以2μg/ml的相应光敏剂避光孵育24h,然后以10J/cm2的激光照射,CCK8法评估胆管癌细胞的增值抑制率。我们还用AO-EB染色法检测HCE6介导PDT治疗后胆管癌细胞凋亡坏死情况。通过Annexin V-FITC/PI双染试剂盒对各组细胞进行流式细胞检测,定量分析各组细胞凋亡坏死情况。我们还收集PDT处理后FRH-0201细胞蛋白,应用western blot方法评估凋亡蛋白caspase-3和caspase-8的表达情况。所有实验数据均用SPSS 21.0统计软件进行分析。以p0.05记为差异具有统计学意义。所有实验均重复三次。研究结果CCK8结果显示,HCE6介导的PDT可以明显的抑制胆管癌细胞FRH-0201和QBC-939的增值,抑制效果与药物浓度和光照强度相关,随着药物浓度增加和光照强度增加,抑制效果逐渐增加,当药物浓度为2ug/ml和光照强度为10J/cm2的时候PDT对胆管癌细胞FRH-0201和QBC-939的抑制效果达到最大,分别为83.6%和84%,并且随着药物浓度和光照强度继续增大抑制效果未发生明显变化。HCE6孵育胆管癌细胞6h、12h、24h后行激光照射,其抑制杀伤效果明显高于3h孵育时间的抑制效果(p0.05),而6h、12h和24h三组之间并无明显的统计学差异(p0.05)。HCE6浓度为2ug/ml时其对胆管癌细胞的抑制效果明显强于传统光敏剂喜泊分和Photofrin的效果,差异具有统计学意义(p0.01)。AO-EB染色结果显示,HCE6介导的PDT组细胞凋亡比例明显高于对照组。流式细胞术结果也证实HCE6介导的PDT可以明显的引起胆管癌细胞FRH-0201的凋亡。Western blotting结果分析显示,HCE6介导的PDT组与其余三组对照组(空白对照组,单独用药组,单独照光组)相比细胞凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达明显增加,单独用药或单独照光并不能引起凋亡蛋白表达增加。结论新型光敏剂HCE6介导的光动力治疗对胆管癌具有明显的抑制杀伤效果,而且与传统光敏剂喜泊分和Photofrin相比具有更高的药效和更短的药物孵育时间。其介导的PDT作用机制主要是促进肿瘤细胞凋亡、诱导细胞凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达。
[Abstract]:Cholangiocarcinoma ( BDC ) has been widely used in the treatment of bile duct obstruction , such as biliary obstruction , esophageal cancer , prostate cancer , head and neck cancer . In order to investigate the effect of HCE6 - mediated PDT on the proliferation inhibition rate of cholangiocarcinoma cells and to evaluate the effect of HCE6 - mediated PDT on the apoptosis of cholangiocarcinoma cells , we also examined the effect of HCE6 - mediated PDT on the apoptosis of cholangiocarcinoma cells .

【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.8

【参考文献】