缺氧和NS398对肾癌786-O细胞生物学行为和靶向治疗的影响

发布时间：2018-05-15 03:22

本文选题：缺氧 + 靶向治疗　；参考：《重庆医科大学》2016年博士论文

【摘要】：第一部分缺氧对肾癌786-O细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响目的:探讨缺氧条件下培养的肾癌786-O细胞在增殖能力、凋亡能力以及迁移能力和侵袭能力等方面有无明显变化;方法:采用含双抗(青霉素和链霉素)、10%胎牛血清的1640培养基培养肾癌786-O细胞,实验组于缺氧培养箱中培养,缺氧条件为37℃,5%CO2,2%O2,93%N2,细胞8小时、12小时以及24小时后进行增殖、凋亡、迁移和侵袭检测。对照组为常氧条件下(37℃,5%CO2,O2 95%)培养的肾癌786-O细胞。采用MTT比色法检测肾癌786-O细胞的增殖的变化;采用Hoechst染色法,荧光镜下取5个高倍视野计数凋亡细胞数、流式细胞术检测细胞凋亡的变化;采用Transwell小室,检测细胞迁移能力的变化;采用Matrigel包被的Transwell小室,检测细胞侵袭能力的变化,结果采用SPSS19.0进行单因素方差分析,P0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.MTT比色法:肾癌786-O细胞培养8小时、12小时以及24小时后,肾癌786-O细胞的增殖分别为(缺氧v.s常氧):97.6±3.6 v.s 96.5±4.2(8h);95.4±2.5 v.s 96.7±2.5(12h);98.1±2.3 v.s 97.3±2.6(24h)。结果显示在各培养时间点,缺氧对肾癌786-O细胞的增殖并无明显影响(P0.05)。2.Hoechst染色结果:肾癌786-O细胞培养8小时、12小时和24小时后,凋亡计数分别为(缺氧v.s常氧):17.2±3.2 v.s 28.2±2.4(8h);18.4±1.9 v.s 26.7±2.2(12h);17.4±2.3 v.s 26.9±2.8(24h),统计分析发现在各培养时间点,缺氧处理的肾癌786-O细胞凋亡受到抑制(P0.05)。3.流式细胞术结果:肾癌786-O细胞培养8小时、12小时和24小时后,细胞凋亡率(%)分别为(缺氧v.s常氧):5.2±1.2 v.s 11.2±1.9(8h);6.7±1.1 v.s 9.7±1.2(12h);6.5±0.9 v.s 9.9±1.6(24h),统计分析发现在各培养时间点,缺氧条件下培养的肾癌786-O细胞凋亡率减少(P0.05)。4.细胞迁移实验结果显示:培养肾癌786-O细胞至8小时、12小时和24小时,计数细胞结果显示:实验组和对照组肾癌786-O细胞迁移数分别为(缺氧v.s常氧)96±7.4 v.s 65±6.7(8h);156±8.4 v.s 94±8.4(12h);320±16.2 v.s 215±12.3(24h)。在各培养时间点,缺氧组细胞迁移数目较常氧组明显增多(P0.05)。5.侵袭实验结果显示:培养肾癌786-O细胞至8小时、12小时和24小时,结果显示侵袭细胞计数分别为(缺氧v.s常氧):46±3.4 v.s22±2.7(8h);86±2.4 v.s 51±3.1(12h);226±16.2 v.s 176±11.9(24h)。统计分析后发现在各培养时间点,缺氧组侵袭细胞数目较常氧组明显增多(P0.05)。因缺氧条件下细胞培养至24h时,检测肾癌786-O细胞侵袭和迁移时候现,穿过室膜数目过多,故后续实验的缺氧时间控制为12h。结论:1.缺氧(37℃,5%CO2,O2 95%)对肾癌786-O细胞增殖能力无明显影响;2.缺氧(37℃,5%CO2,O2 95%)能够显著增加肾癌786-O细胞的抗凋亡能力;3.缺氧(37℃,5%CO2,O2 95%)能够明显促进肾癌786-O细胞的迁移能力;4.缺氧(37℃,5%CO2,O2 95%)能够明显促进肾癌786-O细胞的侵袭能力。第二部分缺氧和NS398对肾癌786-O细胞内HIF 2α、COX2、E-cadherin/Snail蛋白表达的影响目的:探讨缺氧对肾癌786-O细胞内与缺氧和侵袭相关的蛋白表达水平的变化,检测环氧合酶特异性抑制剂NS398对肾癌786-O缺氧细胞内缺氧和侵袭相关蛋白表达以及细胞侵袭能力的影响。方法:1.购买锐博公司合成的si-RNA-HIF 1α、si-RNA-HIF 2α,序列如下:HIF 1α正义链序列(5’-3’):GGGUAAAGAACAAAACACA;反义链序列:UGUGUUUUGUUCUUUACCC(si RNA ID#42840);HIF 2α正义链序列:(5’-3’)GGUUUUGUUGCUAGCCCUU;反义链序列:AAGGGCUAGCAACAAAACC(si RNA ID no.106447),按照说明书将si-RNA-HIFs和Lipofectamine TM 2000混合,采用瞬时转染法,将20n M、50n M、100n M浓度的si-RNA-HIF1α/2α转入肾癌786-O细胞内,48小时后检测荧光镜下检测转染成功的活细胞比例,计算转染效率。2.将转染了si-RNA-HIF1α和si-RNA-HIF2α的肾癌786-O细胞进行缺氧培养和常氧培养,对照组为未转染si-RNA的肾癌786-O细胞。采用Western blotting检测细胞内HIF 1α、HIF 2α蛋白的表达;将转染后的肾癌786-O细胞在缺氧条件下培养3h、8h、12h、24h,Transwell检测侵袭能力的变化,对照组为未转染si-RNA的肾癌786-O细胞;3.将肾癌786-O细胞分2组:缺氧+si-RNA-HIF 1α组,缺氧+si-RNA-HIF 2α组。缺氧条件下培养转染的细胞12h,采用Westernblotting检测肾癌786-O细胞内COX2、E-cadherin/Snail蛋白的表达;4.常氧条件下,将20u M、40 u M、80 u M终浓度的NS398分别与肾癌786-O细胞共培养12h、24h、36h,采用MTT比色法检测细胞增殖活性的变化,对照组不加NS398(0 u M),筛选NS398对肾癌786-O细胞的无细胞毒性作用的浓度;5.将肾癌786-O细胞分成4组,常氧组,缺氧组,常氧+NS398组,缺氧+NS398组,培养时间为12h。环氧合酶特异性抑制剂NS398浓度为40u M。采用Transwell检测肾癌786-O细胞的侵袭能力的变化,Western blotting检测肾癌786-O细胞内HIF 2α、COX2、E-cadherin/Snail蛋白的表达。结果:1.荧光镜下细胞计数后计算转染率,结果显示(%):si-RNA-HIF1α20n M 15±3.6;50n M 46±3.2;100n M 74±8.9。si-RNA-HIF 2α20n M 14.1±2.1;50n M 36.2±5.3;100n M 66±7.4。上述结果显示,运用100n M si-RNA-HIFs能够成功转染肾癌786-O细胞。2.Western blot检测结果显示:肾癌786-O细胞内蛋白表达结果为(缺氧v.s常氧):HIF1α0.61±0.08 v.s 0.14±0.04;HIF2α0.63±0.13,单因素方差分析结果显示:P=0.010.05,缺氧诱导肾癌786-O细胞内HIF1α和HIF2α表达升高。但是,当转染si-RNA-HIF后,无论缺氧还是常氧条件下培养的肾癌786-O细胞内均未能检测到与si-RNA相应的靶蛋白的表达,进一步说明转染成功;侵袭实验结果显示:将si RNA-HIF-1α转入肾癌786-O细胞,与未转染组相比,侵袭的细胞数为分别为43.7±1.2 v.s 48±1.6(3h);94±5.3 v.s 103±2.9(8h);148.7±12.4 v.s 146±12.9(12h);278.7±23.1 vs 300±23(24h),单因素方差分析结果为P=0.840.05,si RNA-HIF-1α对细胞侵袭能力无明显影响。而将si RNA-HIF-2α转入肾癌786-O细胞,与未转染组相比,侵袭的细胞数为分别为43.7±1.2v.s 40±0.8(3h);94±5.3 v.s 56±4.8(8h);148.7±12.4 v.s 100±16.3(12h);278.7±23.1 v.s 183.3±47.1(24h)。单因素方差分析结果显示P0.05,当肾癌786-O细胞转染si RNA-HIF-2α之后,缺氧条件下细胞侵袭能力不再出现增强的变化。由此推断,缺氧诱导的肾癌786-O细胞侵袭能力的增强,受HIF 2α调节。3.Western blotting检测结果显示:缺氧组和对照组相比,肾癌786-O细胞内蛋白表达如下(缺氧v.s常氧):HIF2α0.73±0.066 v.s0.157±0.046;COX2 0.90±0.096 v.s 0.085±0.028;E-cadherin 0.233±0.102 v.s 0.727±0.069;Snail 0.817±0.073 v.s 0.097±0.022。与对照组比较,实验组(缺氧)细胞内HIF2α、COX2表达升高,E-cadherin表达降低,Snail表达升高(P0.05);HIF2α与COX2表达水平呈正相关(P=0.0010.05,r=0.46),COX2与E-cadherin表达水平呈负相关。(p=0.0000.05,r=-0.34)。Western blotting检测转染了si RNA-HIF-1α和si RNA-HIF-2α的肾癌786-O缺氧细胞内蛋白的表达,结果示(si RNA-HIF-1αv.s si RNA-HIF-2α):COX2 0.93±0.20 v.s 0.07±0.03;E-cadherin 0.05±0.02 v.s 0.75±0.10;Snail 1.11±0.28 v.s 0.19±0.05。单因素方差分析结果显示,P=0.0000.05。与未转染组相比较,抑制细胞内HIF 2α的表达(转染si RNA-HIF-2α),导致了细胞内COX2表达降低,E-cadherin表达升高,Snail表达降低,而抑制细胞内HIF 1α后(转染si RNA-HIF-1α),上述蛋白的表达无明显变化。4.MTT比色法结果显示,常氧条件下培养肾癌786-O细胞12小时,NS398浓度不超过40u M,细胞的增殖活性(%)无明显改变,89±11.6 v.s 96±7.2,P0.05,可见NS398浓度为40 u M,作用肾癌786-O细胞12小时,对细胞无直接毒性作用。后续实验为排除NS398可能对肾癌786-O细胞的直接毒性作用,选择40u M浓度作为实验浓度。5.Transwell检测结果显示:常氧组与常氧+NS398组比较,细胞侵袭结果为114.3±26.6 v.s 117.7±26.3,P0.05,常氧条件下,NS398对细胞侵袭能力无明显影响;缺氧组与缺氧+NS398组比较:154±17.7v.s 110±26.9,P0.05,缺氧诱导肾癌786-O细胞侵袭能力增强(前面实验已经证实),而NS398可以在缺氧条件下抑制肾癌786-O细胞增强的侵袭能力。由此可见,缺氧条件下,NS398逆转了肾癌786-O侵袭能力的增强。Western blot检测各种蛋白的表达,HIF 2α在常氧组与常氧组+NS398组中的表达量为别为0.16±0.06 v.s 0.11±0.03,P0.05;HIF 2在α缺氧组与缺氧+NS398组中的表达量分别为0.73±0.06 v.s 0.73±0.03,P0.05;COX2在常氧组和常氧+NS398组的表达量分别为0.095±0.05 v.s 0.085±0.04,P0.05;COX2在缺氧和缺氧+NS398组中的表达量为别为0.9±0.14 v.s 0.18±0.12,P0.05。E-cadherin在常氧和常氧+NS398组中的表达量分别为0.73±0.10 v.s 0.78±0.12,P0.05;E-cadherin在缺氧和缺氧+NS398组中的表达量为别为0.23±0.14 v.s0.72±0.12,P0.05。Snail在常氧和常氧+NS398组中的表达量分别为0.10±0.03 v.s 0.09±0.05,P0.05;Snail在缺氧和缺氧+NS398组中的表达量为别为0.82±0.10 v.s 0.12±0.07,P0.05。由此可见,NS398降低了缺氧肾癌786-O细胞中的COX2的表达,随之出现了E-cadherin表达升高,Snail表达下降。结论:1.采用瞬时转染,成功将si-RNA-HIF 1α、si-RNA-HIF 2α肾癌786-O细胞内,并且能够有效抑制其相应的靶蛋白;2.转染si-RNA-HIF 2α,肾癌786-O细胞在缺氧条件下培养,不再出现细胞侵袭能力的增强,而转染si-RNA-HIF 1α后,肾癌786-O细胞在缺氧条件下,其侵袭能力的增强无明显变化。由此推断,缺氧诱导的肾癌786-O细胞侵袭能力的增强受HIF 2α的调节;3.虽然缺氧诱导了肾癌786-O细胞内HIF 1α和HIF 2α升高,但是仅HIF 2α能够导致靶基因COX2蛋白表达升高,最终引起E-cadherin/Snail通路激活,导致细胞侵袭能力增强,而HIF 1α的表达升高并不能导致COX2及E-cadehrin/Snail通路的激活;4.COX2特异性抑制剂NS398,能够抑制缺氧诱导的COX2的表达升高,导致E-cadherin/Snail失活,使缺氧诱导的肾癌786-O细胞的侵袭能力的变化在缺氧环境中不再出现。第三部分肾癌组织中缺氧侵袭相关蛋白HIF2α、COX2以及E-cadherin/Snail的表达及意义目的:探讨肾癌组织内与缺氧侵袭相关蛋白HIF-2α、COX2、E-cadherin/Snail的表达,分析这些蛋白表达之间的关系、蛋白的表达与肾癌患者的临床分期、病理分级之间的关系。方法:收集2012年1月1日---2015年3月31手术切除的60例肾癌标本,按照2004年WHO推荐的分期法对患者进行临床分期,按照1997年WHO推荐的病理分级方法,对患者标本进行病理分级。统计患者的年龄、性别、肿瘤大小、患者临床分期和病理分级;运用免疫组织化学法检测标本中HIF-2α、COX2、E-cadherin/Snail蛋白的表达并对蛋白进行评分,统计各种蛋白表达量之间的关系、蛋白表达量与患者临床分期和病理分级之间的关系。结果:1.本组病例共60人,术后病理诊断均为肾细胞癌。其中肾脏透明细胞癌30例,嫌色细胞癌5例,乳头状腺癌4例,集合管癌1例。患者年龄最大者79岁,最小者26岁,男性29例,女性21例。超声检查肿瘤直径(最长径)最大者7.4cm,最小者1.8cm。临床分期中,Ⅰ期15例,Ⅱ期25例,Ⅲ期16例,Ⅳ期4例。按照病理级别统计高分化者14例,中分化者27例,低分化者19例。2.在60例肾癌标本组织中,所有标本均行免疫组织化学检测HIF-2α、COX2、E-钙粘素以及Snail蛋白的表达。HIF 2α阳性表达47例(47/60),阴性表达11例(11/60);COX2阳性表达43例(43/60),阴性表达17例(17/60);E-ca阳性表达25例(25/60),阴性表达35例(35/60);Snail阳性表达50例(50/60),阴性表达10例(10/60)。3.肾癌组织中HIF 2α的表达与COX2的表达存在相关性。随着HIF2α表达强度升高,肾癌组织中COX2的表达阳性率逐渐升高,其表达强度亦有所升高(P=0.0010.05,r=0.442)。4.HIF 2α的表达与肾癌临床分期和病理分级之间存在正相关。随着患者临床分期升高,患者HIF 2α表达的阳性率越高。在高临床分期的患者中,HIF 2α的表达强度越高(P=0.0000.05,r=0.439)。肾癌组织病理分级越高,越可能出现HIF 2α高表达,其表达强度与病理分级显著相关(P=0.0360.05,r=0.272)。5.肾癌组织中COX2的表达与Ecadherin的表达之间正相关。在COX2表达阳性的标本中,E-cadherin的表达率显著降低。随着COX2表达强度升高,E-cadherin的表达强度有逐渐降低的趋势,两者呈负相关。(P=0.0000.05,r=-0.509)。6.随着患者临床分期越来越高,肾癌组织中COX2的表达率及表达强度升高;同样,在高分级的肾癌组织中,COX2的表达率上升,表达强度升高。肾癌组织COX2的表达与肾癌的临床分期(P=0.0090.05,r=0.336)、病理分级之间存在正相关(P=0.0180.05,r=0.303)。7.肾癌组织中,E-钙粘素的表达与肾癌的临床分期无显著相关(P=0.0730.05);但是E-钙粘素的表达阳性率和表达强度与肾癌的病理分级存在负相关,E钙粘素的表达越低,患者的病理分级可能越高(P=0.0060.05,r=-0.352)。结论:1.肾癌组织中HIF2α的表达与COX2的表达呈正相关,随着HIF2α阳性表达率升高,COX2的阳性表达率亦升高;2.HIF2α的表达与肿瘤临床分期和分级呈正相关;3.肾癌组织中COX2的表达与E-钙粘素(E-cadherin)之间呈正相关;4.肾癌组织中COX2的表达与肿瘤的临床分期和肿瘤病理分级之间呈正相关;5.肾癌组织中E-cadherin的表达与肿瘤的临床分期无关,与肿瘤的病理分级呈负相关。第四部分缺氧和NS398对肾癌786-O细胞中Sorafenib IC50的影响目的:探讨缺氧和NS398对肾癌786-O细胞中Sorafenib IC50的影响。方法:1.将肾癌786-O细胞分8组,其中4组为实验组,于缺氧条件下培养。对照组于常氧条件下培养。Sorafenib按照2.5u M、5.0 u M、10.0u M、20.0 u M终浓度与肾癌细胞共培养12小时,MTT比色法检测细胞增殖情况,计算不同浓度缺氧和常氧组细胞的抑制率。2.将肾癌786-O细胞分成缺氧组、常氧组、缺氧+NS398组、常氧+NS398组,每个组按照Sorafenib不同浓度再次分成4个小组(2.5u M、5.0 u M、10.0 u M、20.0 u M),培养12小时。采用MTT检测细胞增殖情况,计算各浓度下细胞的抑制率。根据公式细胞抑制率(%)=1-细胞活性(%),计算得出细胞抑制率。SPSS 19.0软件中采用Probit回归模型,分析常氧环境和缺氧环境中肾癌786-O细胞对sorafenib的IC50。结果:1.缺氧条件下培养的肾癌786-O细胞与常氧条件下的肾癌786-O细胞比较,在Sorafenib各浓度下,细胞活性为(缺氧vs常氧)96.6±3.4 vs 78.9±4.41(2.5 u M);85.4±2.6 vs 62.4±2.4(5.0 u M);63±1.9 vs 42.9±2.5(10.0 u M);41.7±2.3 vs 17.2±1.6(20.0 u M)。缺氧组细胞增殖较常氧组明显升高P0.05;Sorafenib IC50分别为:缺氧v.s常氧17.8±2.4u M v.s 7.8±1.5u M。P0.05。2.当肾癌细胞中加入COX2特异性抑制剂NS398(40u M),再次进行Sorafenib抑制试验,结果显示:常氧组IC 50 7.25±2.17(u M);常氧组+NS398 IC50 7.38±2.73(u M);缺氧组IC50 15.01±3.19(u M);缺氧组+NS398 IC50 6.99±1.98(u M)。单因素方差分析结果显示仅缺氧组IC50较其他三组明显升高(P0.05),而常氧组、缺氧+NS398组、常氧+NS398组之间IC50无明显差异。结论:1)缺氧条件培养的肾癌786-O细胞对Sorafenib反应降低,细胞对药物耐受性增加,IC50升高。2)在缺氧条件下,Srafenib联合NS398与肾癌786-O细胞培养,能够有效降低缺氧诱导的Sorafenib IC50升高。第五部分Sorafenib联合NS398治疗缺氧裸鼠肾癌移植瘤的疗效观察目的:探讨缺氧对裸鼠肾癌移植瘤体内生长的影响以及缺氧对Sorafenib治疗裸鼠肾癌移植瘤的效果的影响。方法:1.将60只6周龄雄性BALB/c裸鼠皮下注射肾癌786-O细胞,建立动物肾癌移植瘤模型,检测裸鼠的肿瘤大小。2.肿瘤体积达到40-50 mm3时,按照每组10只随机将动物分成6组。3个组在缺氧条件下饲养并进行相关实验,另外3组在常氧下进行对照试验。分别为缺氧、常氧、缺氧+Sorafenib、常氧+Sorafenib、缺氧+NS398+Sorafenib、常氧+NS398+Sorafenib,待裸鼠在缺氧环境下适应3天后开始给药并测量肿瘤的大小。给药剂量按照Sorafenib 30mg/kg,NS398 3mg/kg进行裸鼠灌胃,1次/日。对照组给予同样容量的药物溶剂。每2-3天测量裸鼠肿瘤的体积及体重。3.3周后处死小鼠,取出肿瘤,Western blotting检测肿瘤内HIF-2α、COX2、E-cadherin及Snail蛋白表达量,并进行统计分析。结果:1.缺氧组和常氧组比较,裸鼠体内的肿瘤体积在给药后第9天开始出现明显变化,肿瘤体积(缺氧vs常氧,mm3)分别为:115.6±6.2 vs 109.5±8.1(9天);315.6±11.2 vs 228.5±7.2(12天);385.6±14.2 vs 346.6±12.6(15天);512.5±13.2 vs 459.6±12.3(18天);698.8±16.5 vs 626.3±16.2(21天),在各个观察时间点,缺氧组裸鼠肿瘤体积较常氧组裸鼠体积明显增大(P0.05)。2.常氧组和常氧组+Sorafenib组比较,各个观察时间点肿瘤体积(缺氧vs常氧,mm3)分别为:109.5±8.1 vs 89.9±6.2(9天);228.5±7.2 vs 164.2±7.1(12天);346.6±12.6 vs 219.3±11.2(15天);459.0±15.2 vs 289.2±11.6(18天);626.3±16.2 vs 426.9±14.2(21天),在各个观察时间点,靶向治疗药物Sorafenib治疗组(常氧组+Sorafenib)较未行靶向治疗的(常氧组)裸鼠体积明显缩小。(P0.05)。3.缺氧+Sorafenib与常氧+Sorafenib及缺氧组比较,各个观察时间点肿瘤体积(缺氧vs常氧,mm3)分别为:108.4±5.8 vs 89.9±6.2(9天);208.6±5.2 vs 164.2±7.1(12天);248.6±5.9 vs 219.3±11.2(15天);425.5±13.9 vs 289.2±11.6(18天);534.8±14.3 vs 426.9±14.2(21天)。在各个观察时间点,给予裸鼠靶向治疗,缺氧组裸鼠肿瘤体积较常氧组裸鼠体积明显增大(P0.05)。4.缺氧+NS398+Sorafenib与常氧+NS398+Sorafenib比较,各个观察时间点肿瘤体积(缺氧vs常氧,mm3)分别为:91.6±4.8 vs 81.9±6.2(9天);162.6±9.1 vs 135.5±7.2(12天);178.2±3.1 vs 182.3±12.7(15天);236.5±9.2 vs 245.0±12.4(18天);315.8±11.2 vs 326.8±12.9(21天)两组肿瘤体积无明显变化(P0.05)。5.Western blotting检测肿瘤组织中HIF2α、COX2、E-cadherin以及Snail蛋白的表达。结果显示:在常氧组内,HIF2α、COX2、E-cadherin以及snail的表达无显著差异;在缺氧组内,上述蛋白的表达亦无明显差异。但是,缺氧组和常氧组之间,上述蛋白的表达存在差异有统计学意义。为进一步研究抗肿瘤治疗过程中,肿瘤体积变化的原因。统计学分析后发现,COX2的表达量与肿瘤组织的体积存在相关性,r=0.972。试验结果进一步说明COX2特异性抑制剂在抗肿瘤过程中能够有效地增强Sorafenib的治疗效果。结论:1.与常氧条件相比较,缺氧能够促进裸鼠体内移植瘤的生长;2.裸鼠体内移植瘤生长的大小,与COX2的表达有关;3.Sorafenib能够有效抑制肿瘤的生长,但是缺氧可促使肿瘤对其反应性降低;4.COX2特异性抑制剂能够增强Sorafenib的抗肿瘤作用,逆转缺氧诱导的肿瘤耐药。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11

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