蛋白质糖基化抑制剂衣霉素与紫杉醇联合用药的抗肿瘤作用研究

发布时间：2018-05-16 22:33

本文选题：衣霉素 + 紫杉醇　；参考：《山东大学》2017年硕士论文

【摘要】：乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一,其中约有15-20%的乳腺癌患者属于三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)。三阴性乳腺癌由于缺乏受体表达,目前尚未发现其特异性的治疗指征,因此是恶性程度及复发率最高、转移最快、预后最差的女性恶性肿瘤。有研究表明PI3K/AKT信号通路在调控肿瘤细胞增殖、分化、运动和代谢中发挥着重要作用,而丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases,MAPKs)信号转导通路与细胞增殖和凋亡有密切关系。PI3K/AKT信号通路和MAPK信号通路的异常活化引起了 TNBC的发生和转移。紫杉醇是一种广泛应用于多种肿瘤治疗的细胞毒类药物。紫杉醇可以通过抑制微管解聚将细胞周期阻碍在G2/M期,进而引发细胞凋亡。然而,有文献报道紫杉醇可以引起PI3K/AKT信号通路和MAPK信号通路的激活进而使肿瘤细胞对紫杉醇产生耐药性。衣霉素作为一种蛋白质N-糖基化抑制剂不仅可以抑制肿瘤生长,还具有降低药物抗性的作用。研究发现,衣霉素不仅通过降低P糖蛋白(Pgp)的糖基化水平降低Pgp功能,而且可以抑制PI3K/AKT和MAPK通路的激活,从而增强乳腺癌细胞对药物的敏感性,促进细胞凋亡。本课题选用三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株,对衣霉素和紫杉醇单独或联合用药的细胞增殖抑制作用进行评价,通过软件处理计算两种药物的相互作用指数,确定药物之间的作用方式。然后对衣霉素和紫杉醇联合用药的增效作用机制进行探讨,首先在细胞水平上研究衣霉素是否会促进紫杉醇诱导的细胞凋亡,并对于紫杉醇引起的周期阻滞及微管蛋白聚合的影响进行研究,之后探讨衣霉素对紫杉醇引起的PI3K/AKT和MAPK信号通路异常激活的影响。在体外水平上进行初步研究后,为了证实体外实验结论的可靠性,我们构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的MDA-MB-2311/GFP荷瘤裸鼠模型,在复杂的机体环境中研究衣霉素和紫杉醇单独或联合用药对于肿瘤生长的抑制作用,并对联合用药的抗肿瘤作用机制进行研究。本论文取得的研究结果如下:1.在MDA-MB-231细胞中,衣霉素与紫杉醇对细胞增殖抑制作用具有协同效应。采用SRB法检测衣霉素和紫杉醇单独或联合用药后MDA-MB-231细胞的数量变化发现,衣霉素或紫杉醇单独给药,对细胞增殖的抑制作用均存在浓度依赖性关系。其中衣霉素的IC50值是4.68±0.25 μg/ml,紫杉醇的IC50值是0.28±0.10μg/ml。不同浓度紫杉醇与衣霉素联合用药组相互作用指数均小于1,说明两种药物联合用药对于MDA-MB-231细胞的增殖抑制存在协同作用。2.衣霉素促进了紫杉醇诱导的细胞凋亡。Annexin V-FITC/PI凋亡检测实验结果显示,衣霉素单独给药会造成6%的肿瘤细胞发生早期凋亡,10.7%的细胞发生晚期凋亡;紫杉醇给药会诱发7.5%的早期凋亡和20%的晚期凋亡。与单独用药相比,衣霉素和紫杉醇联合用药可以显著性提高凋亡细胞(包括22.8%的早期凋亡细胞和22.1%的晚期凋亡细胞)所占比例。通过对MDA-MB-231进行细胞核染色后形态学观察发现,衣霉素给药后会造成细胞核质固缩,证实衣霉素的促凋亡活性。3.在MDA-MB-231细胞中,衣霉素没有改变紫杉醇诱导的细胞周期阻滞,但改变了微管蛋白的聚合。流式细胞仪测定结果表明,衣霉素会造成肿瘤细胞G0/G1期阻滞,而紫杉醇可以将细胞周期阻滞在G2/M期。与紫杉醇单独用药相比,1.0 μg/ml衣霉素与0.1 μg/ml紫杉醇联合用药对于细胞周期分布并没有表现出显著性改变,可见衣霉素对于紫杉醇引起的细胞周期阻滞作用基本无影响。微管蛋白聚合免疫荧光实验证实,衣霉素会降低紫杉醇造成的微管蛋白聚合。通过蛋白免疫印迹实验也进一步表明,衣霉素引起可溶性α-tubulin单体增加,不溶性α-tubulin聚合体降低,也即联合用药导致聚合的微管蛋白数量减少。因此,衣霉素没有改变紫杉醇诱导的细胞周期阻滞,但改变了微管蛋白的聚合。4.在MDA-MB-231细胞中,衣霉素降低了紫杉醇诱导的PI3K/AKT和MAPK信号通路的异常激活。衣霉素对于肿瘤细胞中AKT、ERK、JNK和p38磷酸化的抑制作用存在剂量依赖性。紫杉醇单独用药可以诱导PI3K/AKT和MAPK信号通路的异常活化。与紫杉醇单独给药相比,衣霉素和紫杉醇联合用药后可以降低PI3K/AKT和MAPK信号通路关键蛋白的表达水平和磷酸化水平。5.在荷瘤裸鼠试验中,衣霉素提高了紫杉醇对肿瘤生长的抑制作用。通过对于带有GFP标签的MDA-MB-231细胞转移瘤的观察发现,对照组、衣霉素组、紫杉醇组和联合用药组荧光强度分别为1.57×l010p/s、1.16×1010p/s、7.24× 109 p/s和3.92× 109 p/s。与对照组相比较,三个给药组的荧光总通量均显著性降低;与紫杉醇或者衣霉素单独给药组相比较,联合用药组的荧光总通量显著性降低。肿瘤体积变化检测结果表明,与对照组相比,衣霉素组、紫杉醇组和联合用药组对于移植瘤生长的抑制率分别为21.1%、77.1%和92.9%。联合用药组与两种药物的单独用药组相比存在显著性差异,抑制肿瘤生长效果明显好于两者单独用药。Ki67组织免疫化学染色实验结果显示,对照组、衣霉素组、紫杉醇组和联合用药组Ki67阳性细胞所占比例分别为30.9%、19.9%、15.7%和8.6%。这表明对照组增殖能力强于其他3组药物组,联合用药组对细胞增殖抑制作用强于两种药物单独用药。采用TUNEL法检测肿瘤组织中的细胞凋亡,结果显示紫杉醇单.独用药肿瘤组织中凋亡细胞占比10.2%,而联合给药组中裸鼠肿瘤组织中凋亡细胞占比增加至28.9%,表明衣霉素的加入可以增强紫杉醇引起的细胞凋亡。6.在荷瘤裸鼠的肿瘤组织中,衣霉素降低了紫杉醇诱导的PI3K/AKT和MAPK信号通路的异常激活,增强了肿瘤细胞促凋亡相关蛋白的活化。与体外实验结果相似,在动物水平上检测联合用药对于肿瘤细胞中AKT、ERK、JNK和p38蛋白表达和磷酸化水平的影响发现,衣霉素可以显著性降低这些PI3K/AKT和MAPK信号通路相关蛋白的本底表达和活化。通过对于凋亡相关蛋白caspase3和PARP的表达进行检测表明联合用药具有更好的促凋亡作用。综上所述,通过本课题研究,我们在细胞和动物水平上,初步评价了衣霉素和紫杉醇联合用药治疗三阴性乳腺癌的可行性,证明了两种药物之间存在协同作用。对联合用药增效机制的研究发现,衣霉素降低了紫杉醇引起的PI3K/AKT和MAPK信号通路异常活化,增强了 MDA-MB-231细胞对紫杉醇的敏感性,并增强下游促凋亡相关蛋白的活性,最终导致肿瘤细胞凋亡。
[Abstract]:Breast cancer is one of the most common malignant tumors in women , among which about 15 - 20 % of patients with breast cancer belong to triple negative breast cancer ( TNBC ) . In order to study the effect of adriamycin and paclitaxel on the proliferation , differentiation , movement and metabolism of tumor cells , it is found that it can inhibit the proliferation , differentiation , movement and metabolism of tumor cells . Compared with the control group , the dose - dependent inhibition rate of paclitaxel - induced cell cycle arrest was significantly lower than that of control group . In conclusion , through the study of apoptosis - related proteins caspase3 and parp , we preliminarily evaluated the feasibility of combination therapy for triple - negative breast cancer .
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

【参考文献】