抗肺癌小分子药物的筛选及其作用机制的研究

发布时间：2018-05-17 00:09

本文选题：非小细胞肺癌 + 化疗　；参考：《吉林大学》2015年博士论文

【摘要】：肺癌是近年来发病率和死亡率唯一逐年上升的恶性肿瘤，已成为是世界范围内癌性死亡的主要原因。肺癌分为小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC），其中约占85%的肺癌患者为NSCLC，且绝大多数在诊断时已是晚期，失去了手术治疗机会。目前，化疗在晚期肺癌的治疗中仍起着重要的作用。以铂类为基础的化疗药物对肺癌患者的生存率并无显著提高，且存在一定的毒副作用，即使随着靶向治疗药物的出现，晚期转移性NSCLC患者的生存率也只有一年左右。因此，高效低毒副作用抗癌药物的研发对提高NSCLC患者远期生存率提供了广阔的研究平台。最近的研究表明，诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物抗肿瘤治疗的一个关键因素，已成为国际肿瘤研究的一个热点，也成为筛选抗癌药物的新靶点。因此，对一些选择性针对关键凋亡靶点药物的发现与研究，可能为肺癌的治疗提供一个合理的新方法。许多传统中药因其合理的结构、确切的活性与较高的稳定性，衍生出大量的临床抗肿瘤化学药物，因此传统中药的小分子化合物的研究在抗癌药物的研发中占据十分重要的地位。许多传统中药中的有效成分具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，这些有效成分针对肿瘤细胞恶性增殖的基因靶点，选择性的诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞不产生影响，为肿瘤的治疗提供了新的研究策略，为提高NSCLC患者的治疗结果提供的新的希望。血竭素是一种传统的中药，常用于止血或治疗损伤，血竭素高氯酸盐（Dracorhodin perchlorate，DP）是一种人工合成的血竭素类似物，有报道发现，DP可以诱导人宫颈癌细胞、人黑色素瘤细胞、人乳腺癌细胞、人胃腺癌细胞等恶性肿瘤细胞凋亡。蟾酥已作为重要的抗癌剂广泛应用，可提高癌症病人的生活质量，华蟾酥毒基（Cinobufagin，CG）是蟾酥的主要化合物之一，在一些肿瘤细胞中具有显著的抗肿瘤效果，如人肝癌细胞、宫颈癌细胞、前列腺癌细胞等。然而，DP和CG在抗肺癌治疗方面及其发挥作用的分子机制尚未见报道。异土木香内酯（Dehydrocostus lactone，DL）是传统中药木香中的主要药效成分，在人前列腺癌细胞、人白血病细胞中均有良好的抗癌活性，并能诱导人肺腺癌和大细胞癌细胞凋亡，但在人肺鳞癌SK-MES-1细胞中的作用及其机制尚未见报道。因此我们的研究目的是探讨DP和CG对人NSCLC细胞的影响，，以及DL对人肺鳞癌细胞的抑制作用。在本研究中，选取了四种NSCLC细胞株，人肺鳞癌SK-MES-1细胞、人肺腺癌A549细胞、人大细胞肺癌H460细胞和人非小细胞肺癌H1299细胞进行体外培养，通过MTT细胞增殖实验，我们发现DP和CG可显著抑制NSCLC细胞增殖，通过流式细胞术检测，发现DP和CG可显著诱导NSCLC细胞凋亡。这种生长抑制效应及凋亡诱导效应呈明显的浓度量效关系。首先，我们使用人肺鳞癌SK-MES-1细胞作为实验模型研究DP的抗癌机制。通过流式细胞术检测细胞周期分布，结果显示DP诱导SK-MES-1细胞周期阻滞在G1/G0期。通过流式细胞术检测线粒体膜电位（MitochondrialMembrane Potential，MMP）及细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平，结果显示，DP可明显降低细胞MMP，增加ROS水平。通过蛋白免疫印迹观察细胞周期及凋亡通路调控蛋白表达变化，结果显示，DP能明显增加p53蛋白的表达，同时抑制G1期调控蛋白，成视网膜细胞瘤蛋白（retinoblastomaprotein，Rb）的表达，这些结果表明在DP的作用下可以激活p53信号通路，其转录形成的复合物与Rb蛋白结合，从而抑制pRb活性，阻滞细胞周期在G1期。同时我们还观察到DP通过上调促凋亡蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白Bcl-2，降低线粒体膜电位，从而激活线粒体凋亡信号通路，促进促凋亡因子释放，激活下游天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase），即caspase凋亡蛋白酶的级联反应，最终裂解其底物，多腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly ADP-Ribose Polymerase，PARP）。此外，我们还发现凋亡诱导因子（Apoptosis Inducing Factor，AIF）的表达增高，表明DP可能还通过诱导caspase非依赖的细胞凋亡途径诱导NSCLC细胞凋亡。其次，我们使用人非小细胞肺癌H1299细胞作为实验模型进一步研究小分子药物CG的抗癌机制。H1299细胞为p53基因缺失的细胞株，p53蛋白表达缺失。我们通过流式细胞术检测细胞周期分布，结果显示，CG阻滞H1299细胞周期在G2/M期。同时发现CG能显著上调ROS水平，破坏细胞MMP，并且，当肿瘤细胞给予N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)预处理时，即一种ROS抑制剂，细胞凋亡及MMP降低明显受阻断，这些结果表明CG诱导的H1299细胞凋亡是ROS依赖的。通过蛋白免疫印迹观察细胞凋亡通路调控蛋白表达变化，结果显示，促凋亡蛋白Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，表明线粒体途径被激活，同时，caspase-9及caspase-3被激活，伴随着PARP的裂解，表明caspase途径的参与，最终导致染色质浓缩和DNA降解，触发细胞凋亡。此外，我们还使用人肺鳞癌SK-MES-1细胞作为实验模型研究DL的抗癌机制。通过MTT实验，发现DL可明显抑制肺鳞癌细胞的增殖。通过流式细胞术检测细胞周期分布，结果显示DL阻滞SK-MES-1细胞周期在G1/G0期。通过流式细胞术还发现，DL可明显诱导人肺鳞癌SK-MES-1细胞凋亡。通过蛋白免疫印迹观察细胞凋亡通路调控蛋白表达变化，结果显示，p53表达增高，促凋亡蛋白Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，同时caspase-3被激活，伴随PARP的裂解，这些数据表明在DL诱导的人肺鳞癌细胞凋亡过程中，发生了p53介导的线粒体途径激活。本研究通过不同人肺癌细胞株研究小分子药物DP、DL、CG的抗肺癌作用及其分子机制，结果表明，小分子药物DP和DL通过激活p53信号通路诱导SK-MES-1细胞凋亡，CG通过ROS依赖的方式诱导H1299细胞凋亡，这三种药物都激活线粒体凋亡途径。由此可见无论是DP、DL还是CG都可能发展成为潜在的抗肺癌治疗的化疗药物，这也进一步为其进入临床提供了理论依据。
[Abstract]:Lung cancer is the only malignant tumor which has been increasing in recent years and has become the main cause of cancer death in the world . The lung cancer is divided into small cell lung cancer ( NSCLC ) and non - small cell lung cancer ( NSCLC ) .

Recent studies have shown that inducing apoptosis of tumor cells is a key factor in the anti - tumor therapy of chemotherapeutic drugs , which has become a hot spot in international tumor research and a new target for screening anti - cancer drugs . Therefore , it is possible to provide a reasonable new method for the treatment of lung cancer .

Many traditional Chinese medicines have a reasonable structure , exact activity and high stability , and a large amount of clinical anti - tumor chemical drugs are derived . Therefore , the research of the small molecule compounds of traditional Chinese medicines occupies a very important position in the development of anti - cancer drugs . The effective components in many traditional Chinese medicines have the function of inducing apoptosis of tumor cells , and the effective components of the traditional Chinese medicines can selectively induce apoptosis of tumor cells , thereby providing a new research strategy for the treatment of tumor cells , and providing a new hope for improving the treatment outcome of NSCLC patients .

The effect of DP and CG on human lung cancer cells , human leukemia cells , human breast cancer cells and human gastric cancer cells has not been reported . However , the effect of DP and CG on human lung cancer cells and human leukemia cells has not been reported .

In this study , four NSCLC cell lines , human lung squamous cell carcinoma SK - MES - 1 cells , human lung adenocarcinoma A549 cells , human lung cancer H460 cells and human non - small cell lung cancer cells were cultured in vitro .

The results showed that DP could significantly decrease the expression of p53 protein and decrease the level of reactive oxygen species ( ROS ) . The results showed that DP could significantly decrease the expression of p53 protein and inhibit the expression of reactive oxygen species ( ROS ) in G1 phase . In addition , we found that the expression of apoptosis - inducing factor ( Df ) increased , suggesting that DP might also induce apoptosis in NSCLC by inducing caspase - dependent apoptosis .

The results showed that the expression of caspase - 9 and caspase - 3 increased , and caspase - 9 and caspase - 3 were activated . The results showed that the expression of pro - apoptotic protein Bax increased and the expression of anti - apoptotic protein Bcl - 2 was decreased .

In addition , we also used human lung squamous cell carcinoma SK - MES - 1 cells as an experimental model to study the anti - cancer mechanism of DL . By MTT assay , it was found that DL could significantly inhibit the proliferation of human lung squamous cell carcinoma . The results showed that the expression of apoptotic protein Bcl - 2 was increased by flow cytometry . The results showed that the expression of p53 was increased , the expression of pro - apoptotic protein Bax increased , the expression of anti - apoptotic protein Bcl - 2 was decreased , and caspase - 3 was activated . The data showed that p53 - mediated mitochondrial pathway activation occurred during the apoptosis of human lung squamous carcinoma cells induced by DL .

In this study , the effect of small molecule drug DP , DL , CG on lung cancer and its molecular mechanism were studied by different lung cancer cell lines . The results showed that the small molecule drugs DP and DL induced apoptosis of SK - MES - 1 cells by activating p53 signaling pathway .
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

【参考文献】