Annexin7调控对体内外小鼠淋巴道转移肝癌细胞及其亚细胞组分Ezrin表达改变的影响

发布时间：2018-05-17 06:41

  本文选题：Annexin7 + 调控　； 参考：《大连医科大学》2017年博士论文

【摘要】：背景:肿瘤转移是肿瘤细胞从原生肿瘤位点(也称为原生肿瘤)向次生肿瘤位点转移的过程。肿瘤转移机制非常复杂,有多重因素可以导致肿瘤转移。粘附,扩散,转移是肿瘤转移的主要三个步骤,不同基因和蛋白通路在肿瘤转移过程中的影响也不同。淋巴癌转移是一种更为复杂的过程,包含了多种影响因素,都可导致癌细胞转移至淋巴系统。所有淋巴转移的肿瘤都是恶性的,并且淋巴癌转移常常是高致死率的诱因。肝癌(HCC)作为一种全球高致死率的疾病,位列世界恶性肿瘤排行第二位,全球已有746,000位患者因肝癌而去世。HCC流行病和地方病区域集中在东亚,北非和西非,以及欧洲和美洲的一些区域。HCC最大的挑战是与高度血管瘤及显性异质多细胞系疾病相互作用,导致了传统的化疗药物无效。HCC患者的早期诊断对于提高患者的生存率及生活质量非常关键。Ezrin和Annexin7(A7)在癌症转移中起到重要的作用。然而,Ezrin和A7在淋巴癌转移和肝癌转移中的研究工作并不充分。为了完善这部分工作,我们实验室致力于找到一种新型标志物,这将帮助我们在早期诊断或治疗肝癌、淋巴癌转移的疾病中提供新的靶点,这项研究也应用于评价Ezrin作为疾病诊断、预防LNMHCC的一种生物标志物。Subcellular fraction是一种改变最多、最为高效的生物技术手段,帮助找到疾病的细胞基因和蛋白质的功能位点也有助于帮助研究这些细胞基因和蛋白的实际作用以及他们之间的相互联系。此外,Subcellular fraction也有助于寻找到低复制数目的蛋白质及分辨蛋白质的功能,并且确定它们的生物活性核酸合成过程氧化还原酶蛋白质细胞骨架信号转导通路细胞结构和核苷流动性局部粘贴等等。本研究旨在研究Ezrin表达在高淋巴癌转移细胞系(Hca-F70%)及低淋巴转移细胞系(Hca-P30%),HCC细胞线性的表达及A7对Ezrin表达效果的影响。目的:1、了解Ezrin在淋巴道转移肝癌(LNM-HCC)在体内和体外细胞和组织中的表达规律。2、研究A7对Ezrin在不同水平上的影响及在LNM-HCC体内、体外细胞功能的影响。3、比较Ezrin在不同类型的LNM-HCC亚细胞组分中的表达。4、评价Ezrin的在体内、体外肿瘤组织中的表达能否作为诊断和预防LNM-HCC的生物标志物。方法:利用同种基因型实验鼠,高淋巴癌转移肝癌细胞系(Hca-F70%转移)和低淋巴癌转移肝癌细胞系(Hca-P30%转移),近亲繁殖的615鼠,分别作为体内、体外模型。Hca-F和Hca-P两种细胞株用液氮复苏,并且用无菌PBS洗涤三次,将10%无菌FBS加入无菌1460细胞培养液中培养24小时,5%CO2连续通气24小时,保持温度为37℃。在Hca-F细胞株中上调A7表达(A7-c DNA-Hca-F),并且在Hca-P设计A7基因沉默细胞株(A7-sh RNA-Hca-P)。Geneticin 418(G 418)药物400μg/μl(在细胞培养液中)使用三周,来筛选稳定转染的细胞。q RT-PCR及western blot用于证明A7基因和蛋白表达的稳定性。此外,q RT-PCR、western blot、免疫细胞组织化学、免疫荧光等技术也用来检测Ezrin和Annexin 7基因和蛋白质在母系细胞系上转换的表达。另外,迁徙和入侵实验也可应用于研究我们感兴趣的蛋白质对肿瘤转移现象所起的作用。将不同组细胞以2 x 106细胞/鼠注射到每组615鼠的足垫。将处理过的鼠饲养5周,在第五周后采集原生肿瘤和次生肿瘤组织加入苏木精伊红后研究组织形态学改变,Ezrin表达用免疫组化的方法,利用q RT-PCR和western blot对原生肿瘤和次生肿瘤进行评价,另外,血浆中的Ezrin表达用酶联免疫反应(ELISA)进行测定。结果:体内实验:结果表明,q RT-PCR和western blot结果显示A7稳转后,成功构建上调Hca-F细胞系(高淋巴道转移)和下调Hca-P细胞系(低淋巴道转移)。用于动物模型所构建的细胞在第10天加入A7。亚细胞成功分离后,采用哺乳动物蛋白质提取方法来提取五种亚细胞组分:细胞质、细胞膜、细胞核核膜、核仁和组蛋白带、细胞骨架。在淋巴道转移性肝癌的表达中,我们发现,Ezrin表达与癌细胞转移相关Ezrin和A7在不同HCC细胞株中表现出显著差异的蛋白表达,但是,不同的亚细胞位置Ezrin和A7相关淋巴道转移水平不同;可以解释Ezrin和A7在不同的细胞中生物活性及细胞转移能力相关联。此外,增加Ezrin的表达在A7下调细胞与Ezrin表达减少与A 7上调细胞呈显著相关。这些发现可以确认A 7基因具有肿瘤抑制作用。此外,Ezrin表达与HCC肿瘤转移相关联、Ezrin与A7呈正相关(P0.05)。不同转移水平的淋巴转移肝癌细胞株免疫印迹分析显示Ezrin表达在HcaP(低淋巴道转移)均高于Hca-F(高淋巴转移),差异显著(p=0.0046)。细胞分离分析显示Ezrin的表达高度存在于细胞质、细胞核及Hca-F的细胞骨架。然而,在细胞膜、细胞核和Hca-P细胞骨架中A7上调抑制Ezrin的表达(p=0.0248)并增加迁移和入侵的能力,而Ezrin主要定位于细胞质和细胞核中。Hca-P中A7下调细胞Ezrin表达增强(p0.0001)。Ezrin表达主要集中于细胞质和细胞核,并且抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭。体外实验，

本文编号：1900376