协同刺激分子B7-H1调控IFIT2的机制及其在食管癌中的应用

发布时间：2018-05-17 18:41

本文选题：B7-H1 + 食管癌　；参考：《苏州大学》2016年博士论文

【摘要】：近年来,对肿瘤微环境和肿瘤免疫逃逸机制的深入研究发现,一组介导免疫调节的重要分子—免疫卡控点,如B7家族负性协同刺激分子:B7同系物l(B7 homolog1,B7-H1)可异常表达于人类肿瘤组织及肿瘤浸润的免疫细胞,参与了肿瘤免疫逃逸,并且与患者的临床病理参数及预后密切相关,是肿瘤微环境的重要组成部分。三角形四肽重复干扰素诱导蛋白2(interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 2,IFIT2)是对肿瘤、病毒和各种药物最敏感的干扰素刺激基因。IFIT2可促进细胞凋亡。然而,对IFIT2的生物学功能和其在肿瘤发展中的机制尚不明确。我们使用慢病毒转染及基因干扰技术构建了食管癌细胞株Eca-109中B7-H1表达下调的模型LV-B7-H1-sh RNA,采用基因芯片技术发现,在LV-B7-H1-sh RNA的Eca-109细胞中IFIT2 m RNA水平显著上升,但目前B7-H1与IFIT2在肿瘤中作用机制尚不明确。在本课题中,我们采取食管癌作为研究载体,(1)检测IFIT2和B7-H1在食管癌组织中的表达,探讨IFIT2、B7-H1的关系及IFIT2与食管癌患者临床指标及预后的关系;(2)分别检测B7-H1基因干扰及过表达对食管癌细胞系Eca-109细胞中IFIT2启动子活性的影响,探讨食管癌细胞中B7-H1对IFIT2启动子的调控机制;(3)分别检测B7-H1基因干扰及过表达对食管癌细胞系Eca-109细胞中STAT1、STAT1磷酸化及IFIT2表达水平的影响,抑制JAK及STAT1后检测Eca-109细胞中IFIT2m RNA水平,探讨B7-H1通过JAK-STAT通路调控IFIT2的机制。通过以上工作来探讨B7-H1在食管癌中调控IFIT2的作用机制。本研究结果显示(1)IFIT2主要表达于食管癌细胞及食管上皮细胞的细胞浆和细胞核,在食管癌肿瘤细胞上以低表达为主,在正常的食管上皮细胞上以高表达为主。B7-H1主要表达在食管癌细胞的胞浆及胞膜,在食管癌肿瘤细胞中以高表达为主,而在正常的食管上皮细胞以低表达或不表达为主。男性患者IFIT2染色H-score≥50的比率显著高于女性患者(χ2=9.349,P=0.002);IFIT2染色强度与年龄、T、N、M、TNM分期、肿瘤大小等预后相关因素的关系差异均无统计学意义(P0.05)。Log-rank生存分析显示IFIT2高表达组[57.16(50.83~63.50)]比低表达组[41.58(31.36~51.80)]平均术后生存时间显著延长15.58个月,差异有统计学意义(χ2=6.531,P=0.011)。食管癌组织多因素COX模型分析显示,IFIT2是食管癌独立的正性预后因素(HR=0.41,95%CI=0.19~0.88,P=0.023)。以B7-H1的H-score=140为Cut-off值,H-score140定为高表达,H-score≤140定为低表达;以IFIT2的H-score=25为Cut-off值,IFIT2的H-score25定为高表达,H-score≤25定为低表达。食管癌组织B7-H1与IFIT2表达水平呈显著负相关(r=-0.203,P=0.044)。(2)我们通过基因干扰技术构建食管癌细胞Eca-109中B7-H1表达下调的模型,流式细胞术及q RT-PCR验证稳定转染LV-B7-H1-sh RNA的Eca-109细胞株中B7-H1表达水平显著低于稳定转染LV-Scramble的Eca-109细胞株。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示LV-B7-H1-sh RNA的Eca-109细胞(2.66±0.34)中IFIT2启动子活性显著高于LV-Scramble的Eca-109细胞(1.00±0.19)(P0.001)。我们通过基因过表达稳转细胞系构建技术构建食管癌细胞Eca-109中B7-H1表达上调的模型,流式细胞术及q RT-PCR验证稳定转染LV-B7-H1的Eca-109细胞株中B7-H1表达水平显著高于稳定转染LV-NC的Eca-109细胞株。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示LV-B7-H1的Eca-109细胞(0.43±0.10)中IFIT2启动子活性显著低于LV-NC的Eca-109细胞(1.00±0.18)(P0.01)。(3)食管癌细胞LV-B7-H1-sh RNA细胞中STAT1水平显著高于LV-Scramble细胞,差异有统计学意义(P0.001),LV-B7-H1细胞中STAT1水平与LV-NC细胞差异无统计学意义(P0.05)。LV-B7-H1-sh RNA细胞中phos-STAT1-y701磷酸化水平显著高于LV-Scramble细胞,差异有统计学意义(P0.001),LV-B7-H1细胞中phos-STAT1-y701磷酸化水平显著低于LV-NC细胞,差异有统计学意义(P0.001)。LV-B7-H1-sh RNA细胞中IFIT2水平显著高于LV-Scramble细胞,差异有统计学意义(P0.001),LV-B7-H1细胞中IFIT2水平显著低于LV-NC细胞,差异有统计学意义(P0.001)。LV-B7-H1-sh RNA细胞中IFIT2 m RNA水平显著高于LV-Scramble细胞,差异有统计学意义(P0.05),选取JAK抑制剂AG490处理LV-Scramble及LV-B7-H1-sh RNA的Eca-109细胞后,LV-B7-H1-sh RNA细胞中IFIT2 m RNA升高趋势被抑制,其他JAK抑制剂AZD1480,CP-690550、CYT387处理细胞后,LV-B7-H1-sh RNA细胞中IFIT2m RNA较未处理组差异无统计学意义(P0.05)。LV-Scramble转染LV-Scramble及LV-B7-H1-sh RNA的Eca-109细胞后LV-B7-H1-sh RNA的Eca-109细胞中的IFIT2m RNA表达水平显著高于LV-Scramble(P0.001);LV-STAT1-sh RNA转染LV-Scramble及LV-B7-H1-sh RNA的Eca-109细胞后LV-B7-H1-sh RNA的Eca-109细胞中的IFIT2m RNA表达水平显著高于LV-Scramble(P0.01);LV-STAT1-sh RNA转染的LV-B7-H1-sh RNA的Eca-109细胞中的IFIT2 m RNA表达水平显著低于LV-Scramble转染的LV-B7-H1-sh RNA的Eca-109细胞(P0.01)。通过以上研究我们得出结论:IFIT2在食管癌中低表达,对食管癌的预后判断具有潜在价值。在食管癌组织中IFIT2与B7-H1表达呈显著负相关。B7-H1对IFIT2的启动子活性具有负向调控作用。B7-H1负性调控IFIT2的表达,B7-H1负性调控STAT1磷酸化水平。B7-H1可通过STAT1的途径调控IFIT2的表达。
[Abstract]:The effect of B7 - H1 on the expression of IFIT2 promoter in esophageal cancer cell line Eca - 109 was studied . The survival time was significantly prolonged by 15.58 months ( 蠂2 = 6.531 , P = 0 . 011 ) . The expression level of B7 - H1 was significantly higher in Eca - 109 cell line ( 2.66 卤 0.34 ) than LV - Scramble ( P = 0.044 ) . The expression level of B7 - H1 in Eca - 109 cell line was significantly higher than that of LV - Scramble ( P = 0.044 ) .
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1

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