CCND1在结肠癌中受microRNA-340调控而增加细胞对5-Fu的耐药

发布时间：2018-05-18 07:33

本文选题：CCND1 + miR-340　；参考：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景和目的结肠癌(colorectal cancer, CRC)是发生在结肠部位的消化道肿瘤,发病率有逐渐升高的趋向。其好发于直肠与乙状结肠交界处,高危年龄为40～50岁,男女发病比例为2～3：1。在全球最高影响因子杂志CA-A Cancer Journal for Clinicians最近发表的2015年中国癌症统计数据中表示,结肠癌为我国最常见的肿瘤之一,严重威胁了国人的健康。结肠癌根据组织学病理类型主要分为腺癌、鳞腺癌、鳞癌和未分化癌,其中,腺癌又包括了几个亚型,如管状腺癌、乳头状腺癌、黏液腺癌等。结肠癌早期是指原发灶肿瘤限于粘膜层或粘膜下层者,其治愈率较高,5年生存率已超过80%,而晚期的结肠癌患者由于出现局部淋巴结转移和远处器官侵犯,5年生存率低于50%。肿瘤的发生发展是一个非常复杂的过程,与日常饮食不节、环境的污染以及遗传因素密切相关。其包含各种基因的参与。结肠癌的致病因素很多,目前证据比较明确的包括：1、30%的结肠癌发病与遗传有关；2、不良的饮食习惯,如低纤维、高脂肪、高蛋白饮食,近年来发病率的升高与近年来我国人民生活水平的提高不无关系：3、不良的排便习惯会使有害物质聚集在结肠癌,从而损伤肠粘膜而致癌。在分子水平方面,结肠癌发生发展的分子机制发生的病因主要有以下几个方面：修复基因的突变；3、抑癌基因的失活、功能缺失,如管家基因APC突变后失去对β连环蛋白的调节,从而影响细胞间粘附和相关信号通路；4、原癌基因过表达、激活,如KRAS基因点突变可导致其下游靶蛋白p21的氨基酸的改变,p21的功能出现下降；5、端粒酶长度的改变；6、相关信号通路的异常激活；7、相关凋亡调控紊乱等。细胞周期蛋白Cyclin家族是一类广泛存在于真核细胞中,在细胞周期进展中可循环反复地出现-消失-出现的蛋白质,其中,CCND1,也叫CyclinD1,细胞周期蛋白1,属于高度保守的细胞周期家族蛋白。CCND1的编码基因定位在11q13上,包含5个外显子,全长约15kb。在有生长因子的促进下,CCND1最早在细胞周期中被合成,在合成前期的中期到达峰值。CCND1可与细胞周期蛋白依赖性激酶cyclin-dependent kinases (CDKs),如CDK4或者CDK6结合形成复合体并作为它们的调节亚基,促进细胞周期从G1到S期的转化,完成对细胞周期进程的调控。此外,研究发现,除了促进细胞分裂外,CCND1还具有一些独立于CDKs活性的促进基因转录的功能。作为大家较早认可的原癌基因,CCND1的异常表达通过调控细胞周期使细胞停滞于合成期引起细胞过度增殖进而导致肿瘤的发生。在多种肿瘤中,如结肠癌、膀胱癌、生殖系统肿瘤、胃癌、肺癌等,肿瘤组织的CCND1表达明显高于邻近正常组织的CCND1表达,且与病理类型、肿瘤临床分期等指标相关。另外,CCND1在促进肿瘤的侵袭转移方面,也发挥着举足轻重的作用。文献报导,CCND1的过表达可以在不同肿瘤里,如乳腺癌、胃癌等,促进细胞的侵袭和迁移,导致不良的预后。MicroRNA (miRNAs),是一系列小分子非编码的单链RNA,一般由内源基因编码的约22个核苷酸组成,主要参与转录后基因表达调控。miRNAs有广泛多样的生物学功能,它们参与了人体生命过程中一系列的重要进程,包括早期发育,细胞增殖,细胞凋亡,细胞死亡,脂肪代谢和细胞分化等。miRNAs可以通过识别并互补结合目的基因的3'UTR端来直接靶向目的基因,下调目的基因的表达,调节相关信号通路,进而发挥其生物学功能。miRNAs主要通过以下三种方式发挥抑制靶基因的作用：1、切断靶基因的mRNA分子：niRNAs通过完全互补地结合靶基因的序列而切断了靶基因的mRNA;2、阻碍靶基因的翻译过程：miRNAs可以不影响mRNA的序列,但是可以不完全地结合靶基因的序列进而阻碍靶基因的翻译过程；3、上述两种方式同时进行,一方面切断靶基因mRNA,一方面不完全结合靶基因阻碍翻译。近年来研究表明,miRNAs在肿瘤的发生发展中过程中也发挥了相当大的作用。在各种肿瘤中,我们常常可以检测到多种肿瘤中多种miRNAs的异常表达,包括过表达和表达下调,这种现象也提示我们miRNAs在肿瘤的发生、发展、转移等不同的过程中发挥着不同的作用。从发挥的功能来说,miRNA事实上可以被当作癌基因或者是抑癌基因来看,如miR-21则通过靶向抑癌基因PTEN促进肿瘤细胞生长,而let-7,作为,miRNAs的一种,可以通过靶向调控其下游RAS蛋白来发挥其抑癌的作用。更为重要的是,miRNAs还与细胞对化疗药物的敏感性有关,如在卵巢癌中,过表达的miR-214通过作用于其下游靶基因PTEN,进而导致PTEN的表达下调,从而激活AKT信号转导通路,促进细胞的增殖,导致患者对顺铂(cisplatin)化疗的不敏感。5-Fu,5-氟尿嘧啶,即胸苷酸合成酶抑制药,为临床上治疗常见实体瘤,如结肠癌、乳腺癌、胃癌的常用化疗药物。5-Fu作为抗代谢类化合物,5-Fu进入体内后可转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5F-dUMP),可抑制脱氧胸苷酸合成酶,抑制脱氧尿苷酸(dUMP)甲基化转变为脱氧胸苷酸(dTMP)的进程,进而达到干扰DNA的合成和修复的作用。另外,在体内还可转化为5-氟尿嘧啶核苷,以伪代谢产物形式与RNA整合,干扰蛋白质的合成,导致细胞的凋亡。肿瘤耐药性(drug resistance, DR),导致患者对化疗不敏感,是化疗失败的主要原因之一,他的发生是非常复杂的,需要各种因素参与、共同作用。虽然5-Fu作为恶性消化道肿瘤治疗的一线药物,但是由于肿瘤耐药问题的出现,治疗的总体效果并不是很好。导致5-氟尿嘧啶耐药的原因很多,包括药物活化障碍、体内转运、摄取功能失控、作用靶点酶的数量及活性、代谢异常等。如黏蛋白MUC1(mucinl)的过度表达可以抑制胰腺癌细胞对5-Fu的摄入减少进入导致5-氟尿嘧啶的作用效果减弱,肿瘤细胞对5-Fu的敏感性降低。研究目的分析CCND1在结肠癌组织及正常肠组织中的表达特性;研究干扰CCND1后结肠癌细胞对5-Fu敏感性的变化;研究miR340调控结肠癌细胞对5-Fu的敏感性的影响；验证CCND1为miR340的直接靶向基因。研究内容与方法1.CCND1在结肠癌组织及正常肠组织中表达特性1)用实时荧光定量RT-qPCR技术检测CCND1在结肠癌组织及正常肠组织中mRNA水平表达差异；2)采用western-blotting技术检测CCND1在结肠癌组织及癌旁组织中的蛋白水平表达差异；3)IHC观察CCND1蛋白在结肠癌癌症组织和其对应的癌旁组织的表达情况。2.研究经干扰CCND1作用后,结肠癌细胞对5-Fu的敏感性的变化1)采用siRNA干扰技术,将3个携带干扰CCND1序列的siRNA和对应negtive control的siRNA分别转到2个结肠癌细胞株HCT116和SW480中,通过RT-qPCR和western-blotting在RNA水平和蛋白水平验证干扰效率,筛选出干扰效率最高的片段,进行后续实验;2)铺96孔板,将干扰CCND1的HCT116和SW480细胞和相应的negtive control细胞分别接种到孔板中,加入5-Fu后检测IC50值,观察药物浓度反应效果。3.研究miR340对结肠癌细胞对5-Fu的敏感性的影响1)利用瞬时转染技术,将miR340的mimic分别转入HCT116和SW480细胞中,RT-qPCR检测瞬转效率；2)铺96孔板,将过表达miR340 mimic的SW480细胞和negtive control细胞分别接种到孔板中,加入5-Fu后检测IC50值,观察药物浓度反应效果。4.验证CCND1为miR340的直接靶向基因1)在两株结肠癌细胞HCT116和SW480中转染miR-340的mimic,48小时后RT-qPCR和western-blotting检测CCND1的mRNA水平及蛋白水平;2)在两株结肠癌细胞HCT116和SW480中转染miR-340的inhibitor,48小时后RT-qPCR和western-blotting检测CCND1的mRNA水平及蛋白水平3)用生物预测软件预测到CCND1可能为miR-340的靶基因,miR-340可结合到CCND1的3'UTR端；4)用双荧光素酶报告显示miR-340可直接靶向CCND1。5.统计学分析：采用SPSS 21.0统计软件对结果得到的数据采取统计检测P值,计量资料的数值用x±s来显示。①实时荧光定量PCR检测各种癌和癌旁组织或结肠癌细胞表达量的2-ΔΔC t值的统计使用单因素方差分析方法(ONEWAY ANOVA),如有统计学意义,进行多重比较,采用Dunnett方法；②生存分析用单因素Cox回归模型,再用多因素Cox回归模型确定各参数是否可作为独立预后因素；两组间率的比较采用四格表卡方检验)；③噻唑蓝方法观察药物浓度反应曲线,应该拿析因设计资料的方差分析进行数据处理,结果如果有统计学差异,不同组别之间同一个药物浓度的OD值比较采用unpaired t test,同一个组不同药物浓度测出来的OD值采用One-Way ANOVA方法分析,如果存在统计学上的差异,不同的药物浓度之间的两两比较使用Dunnett统计学方法；④不同处理组间的比值、穿膜细胞数等指标采用两独立样本t检验；以P0.05认定为其结果具有统计学差异。研究结果1.与正常肠组织相比,CCND1的表达量在癌组织中显著偏高,且卡方检验得出表达量与T分期相关(即Ⅲ-Ⅳ期的患者CCND1的表达明显高于Ⅰ-Ⅱ期的患者),与年龄、性别、N分期、临床分期无关。单因素和多因素Cox回归分析得出年龄、N分期与CCND1的表达量可作为独立预后因素。1)通过RT-qPCR检测癌组织及对应癌旁组织中CCND1mRNA含量,发现癌组织的mRNA水平明显高于癌旁组织mRNA水平(P0.01),数据统计应用两独立样本t检验,结果有统计学意义;2)通过western-blotting检测癌组织及对应癌旁组织中CCND1蛋白含量,以GADPH为内参,发现癌组织的CCND1蛋白含量明显高于癌旁组织；3)IHC结果显示,CCND1主要在核表达。与癌旁组织相比,CCND1在癌组织中染色更深,表达细胞比例更多,统计学分析其在两种组织中的表达有显著性差异(P0.01)。CCND1表达量与临床参数之间相关性的统计学分析证明,CCND1的表达量与T分期显著相关(P0.01),即III-IV期的患者CCND1的表达明显高于I-H期的患者,而与性别、年龄、N分期、临床分期无关(P值分别为0.484,0.774,0.135,0.503)；4)经单因素生存分析,年龄、CCND1表达量和N分期都可影响患者的总体生存时间,年龄65岁患者预后差于年龄65岁患者(P0.01),CCND1高表达的患者预后差于低表达者(P0.01),NO患者预后明显好于N1-N2患者(P0.01)。多因素生存分析结果表示,年龄(P0.01)、CCND1表达量(P0.05)以及N分期(P0.01)可以作为患者预后的独立影响因素,而性别、T分期和临床分期(P值分别为0.723,0.262,0.132)均不构成独立影响因素。2.干扰CCND1后,结肠癌细胞对5-Fu的敏感性增加1)采用SiRNA干扰技术,将携带干扰CCND1序列的3个siRNA和对应negtive controlsiRNA分别转到2个结肠癌细胞株HCT116和SW480中,分别于转染后的24小时、48小时通过RT-qPCR和western-blotting来验证CCND1在RNA和蛋白水平的干扰效率,筛选出干扰效率最高的2号片段,48小时的干扰效率分别达79%和68%,故在后续的试验中,选定2号片段,干扰48小时作为实验标准;2)铺96孔板,将干扰CCND1的HCT116和SW480细胞和相应的negtive control细胞分别接种到孔板中,加入5-Fu作用48小时后检测2组细胞的IC50值,观察药物浓度反应效果。结果显示,干扰CCND1后,HCT116和SW480的IC50值均有下降,HCT116细胞的siCCND1组IC50值约为10uM, negtive control组的IC50值为20uM, SW480细胞的siCCND1组IC50值也约为10uM, negtive control组的IC50值约为20uM。经siCCND1干扰后,两株细胞对5-Fu的敏感性均有增加,差异均具有统计学意义(P0.05)。3.过表达miR-340后,结肠癌细胞对5-Fu的敏感性增加1)利用瞬时转染技术,将miR-340的mimic转入结肠癌细胞株HCT116和SW480细胞中,RT-qPCR检测瞬转效率分别高于对应negtive control3倍和4倍(P0.01)；2)铺96孔板,将过表达miR340 mimic的HCT116和SW480细胞及对应的negtivecontrol细胞分别接种到孔板中,加入5-Fu后48小时检测IC50值,观察药物浓度反应效果。结果显示,过表达miR-340后,HCT116和SW480的IC50值均有下降,HCT116中siCCND1组IC50值约为10uM,对照为20uM, SW480中siCCND1组IC50值也约为10uM,对照约为20uM。两株细胞对5-Fu的敏感性均有增加,差异具有统计学意义(P0.05)。4.验证CCND1为miR-340的直接靶向基因1)在两株结肠癌细胞HCT116和SW480中转染miR-340的mimic,48小时后RT-qPCR和western-blotting检测CCND1的mRNA水平及蛋白水平,结果显示两株细胞中CCND1表达水平均明显下降(P0.01)；2)在两株结肠癌细胞HCT116和SW480中转染miR-340的inhibitor,48小时后RT-qPCR和western-blotting检测CCND1的mRNA水平及蛋白水平均有上升(P0.05)；3)用生物预测软件预测到CCND1可能为miR-340的靶基因,miR-340可结合到CCND1的3'UTR端；4)双荧光素酶报告显示miR-340可直接靶向CCND1。结论CCND1在结肠癌中高表达,其表达量与T分期相关(即III-IV期的患者CCND1的表达明显高于I-II期的患者),且年龄、N分期与CCND1的表达量可作为独立预后因素。干扰CCND1后,发现结肠癌细胞对5-Fu的敏感性增加,同样,过表达miR-340后细胞对5-Fu的敏感性也显著增加。通过生物软件预测及双荧光素酶报告证实,miR-340可以直接靶向CCND1。换句话说,CCND1可以受miR-340的抑制从而影响结肠癌细胞对5-Fu的敏感性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35

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