乳腺癌中miR-203、Notch1与JAG1基因甲基化状态与其发生发展的关系

发布时间：2018-05-19 08:12

本文选题：Notch1 + JAG1　；参考：《武汉大学》2016年博士论文

【摘要】：第一部分乳腺癌中Notch1与JAG1基因甲基化状态与其发生发展中的关系目的：Notch1及其配体JAG 1基因甲基化在肿瘤的发生和发展中可能起重要作用。本研究旨在探讨Notch1和JAG 1基因甲基化在乳腺浸润性导管癌发病中的作用。方法：本研究运用MassArray检测Notch1及其配体JAG1甲基化状态在乳腺浸润性导管癌(IDC；n=96)、乳腺导管原位癌(DCIS；n=33)、不典型乳腺导管增生症(ADH；n=33)以及普通型乳腺导管增生症(UDH；n=33)中的改变。运用SP免疫组化法测定这4种乳腺组织中Notch1及其配体JAG1蛋白的表达。结果：(1)Notch1蛋白在乳腺IDC和DCIS中的阳性率分别为91.7%(88/96)和72.7%(24/33),两者的表达均高于ADH组36.4%(12/33)和UDH组(24.2%,8/33),差异有统计学意义(P0.05)。在IDC组中Notch1蛋白表达越高则乳腺癌的淋巴结转移越显著、病理学分级越高和TNM分期越晚,其关系为正相关(P0.05)。Notch1基因启动子区域CpG_3、CpG_4.5、CpG_8位点的平均甲基化率IDC组低于DCIS、ADH和UDH组(P0.0083)。乳腺癌组织中Notch1基因CpG_4.5、CpG_10.11、CpG_13.14、CpG_16位点的平均甲基化水平在乳腺浸润性导管癌区域淋巴结阴性组高于区域淋巴结阳性转移组(P0.05)；在乳腺浸润性导管癌不同TNM分期中CpG_7、CpG_8、CpG_13.、CpG_18位点的平均甲基化水平存在统计学差异,Ⅲ期Ⅱ期Ⅰ期(P0.001)；在不同组织病理学分级中Notch1基因的启动子区域中CpG_3、CpG_8、Cp G_11.12位点的平均甲基化水平具有统计学意义,Ⅲ级Ⅱ级Ⅰ级(P0.05)；CpG_3、CpG_8、CpG_13.14.、CpG_16位点的平均甲基化率在ER+PR+C-erbB-2-组低于ER-PR-C-erbB-2+组(P0.05)。(2)JAG1蛋白在乳腺IDC和DCIS中的阳性率分别为86.5%(83/96)和75.8%(25/33),两者的表达率均高于ADH组(45.5%,15/33)和UDH组(27.3%,9/33),差异有统计学意义(P0.05)。在IDC组中JAG1基因蛋白表达水平与乳腺癌的淋巴结有否转移、病理学分级和TNM分期均呈正相关(P0.05)。JAG1基因启动子区域CpG_2、CpG_6、Cp G_13、CpG_20.21.22、CpG_23.24.25、CpG_26位点在IDC组中的平均甲基化率低于UDH、ADH、DCIS组(P0.0083)。浸润性乳腺癌组织中JAG_1基因中CpG_5、CpG_15、CpG_18位点的平均甲基化状态在有无区域淋巴结转移中具有统计学差异,其中在乳腺癌区域淋巴结阳性转移组低于区域淋巴结阴性转移组(P0.05)；在乳腺浸润性导管癌TNM不同分期间CpG_3、CpG_6、CpG_10、CPG_29.30位点的平均甲基化状态存在统计学差异,Ⅲ期Ⅱ期Ⅰ期(P0.05)。在病理学分级中JAG1基因的启动子区域中CpG_11.12、CpG_14、CpG_27位点的平均甲基化水平具有统计学差异,Ⅲ级Ⅱ级Ⅰ级(P0.05)。同时在乳腺癌受体中CpG_8.9、CpG_17、CpG_27位点的平均甲基化状态在ER+PR+C-erbB-2-组高于C-erbB-2+组(P0.05)。结论：Notchl及其配体JAGl在乳腺浸润性导管癌组织中存在广泛的低甲基化状态,但他们的蛋白表达水平显著升高。Notchl及其配体JAG1甲基化状态和它们蛋白表达呈负性相关,其表明Notchl及其配体JAGl的广泛低甲基化也许导致其蛋白表达增强,这种负性相关也许是导致乳腺浸润性导管癌发生发展的重要原因。Notchl基因中CpG_3、CpG_4.5、CpG_8位点和JAG1基因中CpG_2、CpG_6、Cp G_13、CpG_20.21.22、CpG_26、CpG_29多个位点的甲基化状态降低与乳腺浸润性导管癌的发生显著相关,提示该两种基因特定CpG位点的甲基化状态降低也许参加了乳腺组织从良性病变向恶性改变的发展演变各阶段。第二部分乳腺浸润性导管癌中miR-203和Notch1基因的表达及临床病理关系目的：检测miR-203和Notch1基因mRNA及其蛋白在浸润性乳腺导管癌及增生性乳腺病变中的表达,探讨其在浸润性乳腺导管癌和增生性乳腺病变中的作用和临床病理特征的关系。方法：应用一步法RT-PCR检测乳腺浸润性导管癌(IDC)及癌旁组织各60例新鲜标本中miR-203、Notch1的mRNA表达；同时采用免疫组化SP法检测96例石蜡包埋乳腺浸润性导管癌、99例乳腺增生性病变和22例正常乳腺组织中Notch1蛋白的表达,并结合乳腺癌中ER、PR与C-erbB-2蛋白表达进行分析。结果：1.RT-PCR结果显示：(1)miR-203在乳腺浸润性导管癌60例和癌旁组织60例中的表达水平分别为12%、89%,在乳腺浸润性导管癌及相应正常乳腺组织中miR-203的表达强度显著降低(P0.05)；Notch1在乳腺浸润性导管癌及相应的癌旁组织中表达水平分别是95.2%、39.1%,其差异有显著统计学意义(P0.05)。(2)区域淋巴结转移中：miR-203表达强度标准化系数显示阳性组显著低于阴性组,NoN1N2期,miR-203表达强度标准化系数中位数分别为1.76、0.58和1.05；Notch1基因mRNA表达强度标准化系数显示阳性组显著高于阴性组,NoN1N2期,Notch1表达强度标准化系数中位数分别为0.56、1.08和2.12。(3)临床TNM分期：miR-203表达强度标准化系数中位数在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期各为1.89、1.10、0.53。两两比较显示Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期,有显著统计学差异(P0.05)；Notch1表达水平标准化中位数在Ⅰ期为1.89、Ⅱ期为1.10和Ⅲ期为0.53。两两比较显示Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期(P0.01)。(4)组织学分级中：miR-203mRNA在乳腺浸润性导管癌组织中Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级表达强度标准化系数中位数为1.14、0.81和0.54,Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级(P0.05)；Notch1mRNA在乳腺浸润性导管癌组织中表达强度标准化系数中位数Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级为10.43、0.77和1.32,Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级(P0.05)。(5)ER、PR和C-erbB-2表达的关系：miR-203基因mRNA在ER、PR、C-erbB-2(-)、(+)、(++)、(+++)表达强度标准化系数中位数分别为2.14、1.81、1.54和0.32,在ER、PR、C-erbB-2(-)与ER、PR、C-erbB-2(++)、(+++)具有统计学意义(P0.001)。Notchl基因mRNA在ER、PR、C-erbB-2(-)、(+)、(++)、(+++)表达强度标准化系数中位数分别为0.14、0.81、1.64和2.52,在ER、PR、C-erbB-2(-)与ER、PR、C-erbB-2(++).(+++)具有统计学意义(P0.001)；然而在ER、PR、C-erbB-2(-)与(+)组及(+)与(++)组、(++)与(+++)组间不具有统计学差异(P0.05)。2.免疫组化结果显示：Notch1蛋白在乳腺正常组织中阳性表达率为33.82%,UDH阳性表达率为39.39%。ADH中阳性表达率为72.73%。DCIS中表达阳性率为84.85%；IDC阳性表达率为92.29%。可见Notch1蛋白表达水平在正常组织、UDH、ADH、DCIS及IDC中的逐渐增强。统计结果显示：ADH和UDH分别与DCIS比较Notch1的表达差异有统计学意义(P0.05)；正常乳腺组织和IDC组织中Notch1的表达有显著统计学差异(P0.05)。3.miR-203基因mRNA表达强度在正常乳腺组织、UDH、ADH、DCIS及IDC中分别为1.36、0.98、0.79、0.66和0.42。显示在上述五种乳腺组织中其蛋白水平为逐渐减弱趋势。两两比较乳腺正常组织与DCIS及IDC,有显著统计学差异(P0.01),同时DCIS与乳腺正常组织比较,有显著统计学差异(P0.01)。Notch1基因mRNA表达强度在乳腺正常组织为0.36、UDH为0.68、ADH为0.79、DCIS为1.06及IDC中为1.56。显示在上述五种乳腺组织中其蛋白水平为逐渐增强趋势。在两两比较乳腺正常组织与DCIS及IDC,有显著统计学差异(P0.01)。4.乳腺癌中miR-203和Notch1蛋白表达的关系：Notch1蛋白表达低患者例(43),较高表达患者例(17)。分析表明miR-203和Notch1在乳腺浸润性导管癌及相应癌旁组织中均呈负性相关。相关系数分别为-0.246(P0.05),-0.286(P0.05)。结论：(1)异常表达的miR-203和Notch1基因与乳腺浸润性导管癌有相关,两基因在乳腺浸润性导管癌发生发展中的所起的作用也许不同。(2)miR-203和Notch1在乳腺浸润性导管癌和不同乳腺增生性组织中其蛋白表达强度存在差异。(3)miR-203和Notch1蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中表达为负性相关；在乳腺浸润性导管癌发生发展过程中miR-203和Notch1基因异常表达在可能起着非常重要的调控作用。第三部分乳腺癌中miR-203和Notch1基因甲基化状态与其发生发展中的关系目的：：miR-203和Notch1基因甲基化在肿瘤的发生和发展中可能起重要作用。本研究旨在探讨miR-203和Notch1基因甲基化在乳腺浸润性导管癌发生中的作用。方法：采用MassArray方法对乳腺浸润性导管癌(IDC；n=96)、乳腺导管原位癌(DCIS;n=33)、乳腺非典型性导管增生症(ADH；n=33)以及乳腺普通型导管增生症(UDH；n=33)进行miR-203、Notch1基因甲基化的定量检测。运用SP及RT-PCR法测定这4种乳腺组织中miR-203和Notch1蛋白的表达。结果：(1)miR-203基因基因启动子区域CpG_1.2、CpG_3、CpG_8、CpG_9、CpG_10.11、CpG_14.15.16、CpG_19、CpG_23、CpG_24、CPG_25.26、CpG_27、CpG_28.29、CpG_30.31位点甲基化状况从UDH、ADH、DCIS和IDC标本中平均甲基化率呈逐渐下降趋势；CpG_5.6、CpG_25.26位点的平均甲基化率在乳腺浸润性导管癌和导管原位癌分别为22.6%和28.3%,甲基化水平高。miR-203基因启动子CpG_8、CpG_10.11位点在乳腺癌区域淋巴结转移阳性组平均甲基化率(分别为2.5%、3.1%),区域淋巴结转移阴性组的平均甲基化率(分别为9.1.%、8.6%),两者之间的有统计学差异(P0.05)。乳腺浸润性导管癌miR-203基因启动子CpG_8.和CpG_19.20位点的甲基化水平在TNM分期间存在差异(p0.05)。采用Wilcoxon秩和检验进行两两比较,结果为乳腺浸润性导管癌miR-203基因启动子CpG_8、CpG_16.17位点的平均甲基化率Ⅰ期(18.1%)Ⅱ期(9.5%)Ⅲ期(1.5%)。CpG_4.5位点的平均甲基化率Ⅰ期(25.3%)Ⅲ期(53%),CpG_20.21位点Ⅱ期(18.2%)Ⅲ期(29.5%)(p0.0083)。乳腺浸润性导管癌miR-203基因启动子区域中CpG_8位点的平均甲基化率Ⅰ级(18.5%)Ⅲ级(7.4%)、CpG_10.11位点Ⅰ级(16.3%)Ⅲ级(7.4%)；两者之间的差异有统计学意义(p0.0083)；CpG_4.5、CPG_20.21位点Ⅰ级(22.4%)Ⅲ级(36.4%)。CPG_25.26位点Ⅰ级(22.4%)Ⅲ级(36.4%)。在乳腺浸润性导管癌ER+PR+HER2—与ER—PR—C-erbB-2+之间中的比较,结果显示乳腺浸润性导管癌miR-203基因启动子区域中位点CpG_3、5、CpG_9、CpG_14.15、CpG22.23的平均甲基化率在ER+PR+ C-erbB-2—(25.6.3%)ER-PR-C-erbB-2+(6.3%),之间的差异有统计学意义(p0.05)。(2)Notch1基因启动子区域CpG_3、CpG_4.5、CpG_8位点的平均甲基化率在IDC组低于DCIS.ADH和UDH组,差异有统计学意义(P0.0083)。乳腺浸润性导管癌Notch1基因启动子区域CpG_4.5、CpG_8、CpG_10、CpG_15、CpG_18位点的平均甲基化率在区域淋巴结转移阴性组(16.3%)区域淋巴结转移阳性组(3.2%)(p0.0083)。乳腺浸润性导管癌Notch1基因启动子CpG_4.5、CpG_19位点的甲基化水平在临床中不同TNM分期之间存在差异(p0.0083)。乳腺浸润性导管癌Notch1基因启动子CpG_4.5、CpG_19位点的平均甲基化率Ⅰ期(18.1%)Ⅱ期(9.5%)Ⅲ期(1.5%)。CpG_8位点的平均甲基化率Ⅰ期(25.3%)Ⅲ期(53%),CpG_12.13位点Ⅱ期(18.2%)Ⅲ期(29.5%),两者之间的有统计学差异(p0.0083)。Notch1基因启动子区域中CpG_1.2、Cp G_12.13位点的平均甲基化率Ⅰ级(16.5%)Ⅲ级(8.4%)、CpG_10.11位点Ⅰ级(17.6%)Ⅲ级(6.5%)；两者之间有统计学差异(p0.0083)。乳腺浸润性导管癌Notch1基因启动子CpG_3、CpG_8、CpG_14.15.16位点的平均甲基化率在ER+PR+C-erbB-2-(3.6%)ER-PR-C-erbB-2+(19.3％)之间有统计学差异(p0.05)。(3)4种乳腺病变组织中miR-203和Notch1基因启动子区域所有CpG位点的平均甲基化水平总量存在差异(P0.05)。在IDC组织中miR-203基因启动子区域所有CpG位点的平均甲基化率为36.27%,Notch1基因启动子区域所有CpG位点的平均甲基化率为14.86%,前者高于后者(P0.05)。将4组乳腺组织进行两两比较,统计学分析后结果表明,miR-203基因启动子区域CpG_4.5、CpG_10.11、CpG_21.22位点和Notch1基因启动子区域CpG_3、CpG_4.5、CpG_9位点的平均甲基化率在IDC组小于其余3组,差异有统计学意义(P0.0083)。miR-203基因所有CpG位点平均甲基化水平与它蛋白表达强度之间出现正性相关(r=2.12),具有统计学意义(P0.05)。Notch1基因所有CpG位点平均甲基化多少与它蛋白表达状况之间呈负性相关(r=-0.82),具有统计学意义(P0.05)。结论：在乳腺浸润性导管癌组织中存在miR-203和Notch1基因的广泛低甲基化,同时miR-203蛋白表达显著降低,Notch1蛋白表达显著增强。他们呈现负性相关,提示miR-203和Notch1基因广泛低甲基化可能导致其蛋白表达发生变化,这在乳腺浸润性导管癌的发生发展中可能起着非常的重要的作用。miR-203基因启动子区域CpG_4.5、CpG_10.11、CpG_21.22位点和Notch1基因启动子区域CpG_3、CpG_4.5、CpG_9位点的平均甲基化水平降低与乳腺浸润性导管癌发生发展具有显著相关,表明相关基因特定的CpG位点的甲基化水平降低也许在乳腺组织从良性轻度增生向恶性转化的发生演进中起着重要作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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