miR-214-3p在肝癌中的功能及其机制研究

发布时间：2018-05-20 18:04

  本文选题：肝癌 + 转移　； 参考：《天津医科大学》2017年博士论文

【摘要】：目的:在世界范围内,原发性肝癌(Hepatocellular caicinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,而且其中半数以上的原发性肝癌新发和死亡病例在我国发生。目前,越来越多的研究发现,在原发性肝癌中表达水平失调的microRNA与增殖、转移、血管生成、凋亡、上皮-间质转化等多个原发性肝癌的发生发展过程相关。因此,本研究的目的主要为在众多的microRNA中,找出原发性肝癌中表达水平失调的microRNA,并研究表达水平失调的microRNA在原发性肝癌发生发展过程中对增殖、粘附、迁移、侵袭、凋亡、血管生成等重要生物学功能的影响,并对microRNA发挥作用的直接靶基因进行预测和验证,来探究micro RNA在原发性肝癌发生发展过程中发挥作用的具体机制。方法:1、使用多种分析方法对美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中公开发布的microRNA高通量芯片数据进行分析,初步筛选在原发性肝癌组织中表达水平失调的microRNA,并通过查阅分析文献和具体分析microRNA芯片数据确定进一步研究的目标microRNA。2、用收集的原发性肝癌组织样本和癌旁组织样本,六种肝癌细胞系BEL-7402、SMMC-7721、SK-HEP-1、HuH-7、Hep G2、Li7以及人正常胎肝细胞系L02进行实时定量PCR实验,验证mi R-214-3p是否的确在原发性肝癌组织和细胞系中表达水平降低。3、对原发性肝癌组织的miR-214-3p表达水平和临床病理信息进行相关性分析。4、将miR-214-3p mimics转染入BEL-7402、SMMC-7721、SK-HEP-1三种肝癌细胞系,上调miR-214-3p的表达水平,并进行MTS增殖实验、transwell迁移实验和transwell侵袭实验,来研究mi R-214-3p在原发性肝癌发生发展过程中对增殖、迁移、侵袭等重要生物学功能的影响。5、建立人肝癌裸鼠经血途径肺转移模型,将预先用miR-214-3p agomir孵育的SK-HEP-1细胞经尾静脉注射接种入裸鼠体内,动物整体活体成像观察后再取裸鼠肺进行成像观察和HE病理染色,计数分析转移灶。6、通过使用TargetScan等软件预测miR-214-3p发挥作用的直接靶基因。7、通过临床标本的miR-214-3p荧光原位杂交和HMGA1免疫荧光实验分析HMGA1和miR-214-3p的共表达情况,并通过双荧光素酶报告实验来确定miR-214-3p是否特异性结合HMGA1基因的3’-UTR区。8、进行miR-214-3p的拯救实验,即构建缺失3’-UTR的HMGA1过表达载体,与mi R-214-3p mimics共转染入BEL-7402、SMMC-7721、SK-HEP-1三种肝癌细胞系,进行MTS增殖、transwell迁移和transwell侵袭实验,来探究miR-214-3p多大程度上是通过HMGA1来影响下游的生物学功能。结果:1、分析GSE36915芯片数据后我们发现:和非肿瘤肝脏组织相比,有49个较高丰度microRNA在原发性肝癌组织中的表达水平明显降低,其中,miR-199a-2/214簇中的三个microRNA成熟体miR-214-3p、199a-5p、199a-3p均明显下调,其中miR-214-3p降低幅度最大;与非肿瘤肝脏组织相比,85%(58/68)原发性肝癌组织中miR-214-3p的表达水平都明显下调。2、芯片分析结果的验证实验证实了肝癌组织样本中miR-214-3p的表达水平明显低于癌旁组织样本,此外六种人肝癌细胞系中miR-214-3p的表达水平也均明显低于人正常胎肝细胞系L02。3、miR-214-3p的表达水平降低与原发性肝癌TNM分期(P=0.0002)、远端转移(P=0.0046)密切相关,但与年龄、性别、甲胎蛋白水平、肿瘤大小、肝硬化没有明显相关性。4、与对照组相比,BEL-7402、SMMC-7721和SK-HEP-1三种细胞在转染miR-214-3p mimics 48小时后,增殖受到明显抑制;迁移过transwell小室的细胞数量明显减少;侵袭过transwell小室的细胞数量也明显减少。5、miR-214-3p agomir组的动物整体活体成像荧光信号、肺成像荧光信号和肺转移灶数量均显著低于或少于miRcontrol agomir组(P值情况分别为P0.01、P0.05、P0.05)。6、在TargetScan和mi Randa两大数据库均显示HMGA1为miR-214-3p的预测靶基因。7、肝癌临床标本的miR-214-3p荧光原位杂交和HMGA1免疫荧光实验结果显示,miR-214-3p和HMGA1的表达呈负相关。双荧光素酶报告基因实验显示miR-214-3p mimics对HMGA1 3’-UTR野生型报告载体组荧光素酶活性产生了明显抑制作用(P0.01),而对3’-UTR突变型报告载体组荧光素酶活性则没有明显影响。8、拯救实验表明过表达HMGA1可以减弱转染miR-214-3p mimics对BEL-7402、SMMC-7721和SK-HEP-1三种肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制作用并接近对照细胞水平。结论:miR-199a-2/214簇中的三个microRNA成熟体miR-214-3p、199a-5p、199a-3p在肝癌中的表达均明显下调;miR-214-3p通过靶向结合并下调HMGA1的表达来抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
[Abstract]:Objective : To investigate the role of micro RNA in the development of primary liver cancer . The expression level of miR - 214 - 3P was significantly lower than that of non - tumor liver tissues . Conclusion : The expression of miR - 214 - 3P , 199a - 5p , 199a - 3P in human hepatocellular carcinoma ( HCC ) is significantly lower than that of control cells .
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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本文编号：1915680