hMAM在乳腺癌诊断、预后及靶向治疗中的应用研究及临床意义

发布时间：2018-05-21 06:07

本文选题：乳腺癌 + 人乳腺球蛋白　；参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,并且死亡率较高。近年来我国乳腺癌的发病率迅速攀升,并且患者呈年轻化趋势,在某些经济发达地区,乳腺癌发病率甚至已居女性恶性肿瘤的首位。目前乳腺癌的治疗效果并不理想,主要原因是乳腺癌易发生微转移,从而导致患者治疗后易出现局部复发及远处转移。因此,近年来乳腺癌已逐渐被视为一种全身性疾病,即使是无临床及影像学转移证据的早期乳腺癌,也应被认为是系统性疾病。鉴于乳腺癌的生物学特征,其早期精准诊断及微转移的及时发现显得尤为重要,这就需要一种特异性及灵敏度均较高的乳腺癌分子标志物。人乳腺球蛋白(human mammaglobin, hMAM)是子宫球蛋白家族成员,其可能作为新的分子标志物用于乳腺癌的诊断及预后评估。对这一新的分子标志物在乳腺癌组织中表达及意义的研究将为其临床应用奠定基础。目的分析hMAM蛋白在乳腺癌组织中的表达情况,探讨乳腺癌组织中hMAM蛋白表达与临床病理学参数的相关性,明确hMAM作为乳腺癌特异性诊断及预后分子标志物的可行性。方法回顾性分析检测安徽医科大学附属省立医院2012年1月至2014年12月期间确诊的乳腺疾病患者组织样本,包括乳腺原发性浸润性癌、乳腺原位癌及乳腺良性病变。乳腺浸润性癌及部分乳腺原位癌患者行根治性或改良根治性切除术,部分乳腺原位癌及乳腺良性病变患者行局部手术。所有患者术前均未接受任何治疗。同时选取非乳腺来源恶性肿瘤组织以及正常组织作为对照。免疫组织化学染色检测乳腺浸润性癌组织中hMAM及GCDFP-15表达情况,并分析hMAM蛋白表达与GCDFP-15表达及临床病理学参数的关系；免疫组织化学染色检测乳腺原位癌及良性病变组织中hMAM表达情况,并检测非乳腺来源恶性肿瘤及正常组织中hMAM表达情况。组间阳性率比较及阳性率与临床病理学参数的相关性分析均采用Pearson's卡方检验方法,P0.05为差异具有统计学意义。结果1. hMAM蛋白在乳腺浸润性癌组织中有两种表达模式,一种定位于肿瘤细胞浆(50/58),另一种为定位于肿瘤细胞膜(8/58)。2. hMAM蛋白在良性乳腺疾病中的表达率为3.77%(2/53),在乳腺原位癌中的表达率为20.51%(8/39),而在乳腺浸润性癌中的表达率为72.50%(58/80)。统计学分析显示,hMAM蛋白表达在良性乳腺疾病与乳腺原位癌之间、良性乳腺疾病与乳腺浸润性癌之间以及乳腺原位癌与乳腺浸润性癌之间均存在显著性差异(P0.01)。3. hMAM蛋白在121例非乳腺肿瘤组织中均不表达,包括63例消化系统肿瘤、7例呼吸系统肿瘤、32例泌尿生殖系统肿瘤及19例其它系统肿瘤。4. hMAM蛋白在4例人正常乳腺组织中均低表达,而在其余36例人正常组织中均不表达。5. hMAM蛋白在乳腺浸润性癌组织学分级Ⅰ级、Ⅱ级及Ⅲ级中的表达率分别为79.2%、63.6%、78.3%,其表达与肿瘤组织学分级无相关性(P=0.33)。hMAM蛋白表达率在临床Ⅰ期乳腺浸润性癌中为55.6%(5/9),Ⅱ期为66.0%(33/50),Ⅲ期为95.2%(20/21),其表达与肿瘤临床分期相关(P=0.02)；hMAM蛋白表达率在腋窝淋巴结转移组为92.5%(37/40),在腋窝淋巴结无转移组为52.5%(21/40),其表达与腋窝淋巴结转移相关(P0.01)；hMAM蛋白表达与GCDFP-15的表达具有相关性(P0.01)。结论1. hMAM在乳腺癌肿瘤组织中特异性高表达。2. hMAM表达与乳腺癌标志物GCDFP-15表达具有相关性,因此可作为乳腺癌又一特异性分子标志物。3. hMAM表达与肿瘤临床分期及淋巴结转移相关,因此可作为乳腺癌预后评估分子标志物。4. hMAM具有乳腺癌细胞膜表面表达模式,因此可作为乳腺癌靶向治疗分子标志物。背景乳腺癌微转移是乳腺癌复发的重要原因,肿瘤细胞可在手术过程中经由多种途径进入血液,或是在术前即已存在隐匿的微小转移癌灶。微转移的术后检测及治疗中监测可为乳腺癌预后评估及处理方案制定提供重要参考。对于乳腺癌肿瘤细胞微转移,既往一直缺乏特异性的分子标志物及理想的检测方法。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)近年来日益受到关注,CTC检测在乳腺癌的诊断、治疗及监测中具有如下作用：(1)可以实时地多次进行取样及检测,实现了实时检测(POCT, point of care test); (2)早期肿瘤细胞即可释放进入外周血,因此外周血中CTC检测有助于早期乳腺癌的诊断；(3)外周血中出现CTC是乳腺癌微转移的重要提示,外周血CTC检测可用于判断乳腺癌患者是否有可能发生远处转移,有助于乳腺癌复发检测及预后评估；(4)乳腺癌治疗过程中,外周血CTC检测可实时监测疗效,及时调整或制订个体化治疗方案。有鉴于此,近年来,CTC在乳腺癌早期诊断、疗效检测及复发监测中应用研究逐渐成为热点。外周血CTC检测的准确性及特异性取决于三个因素,即CTC分离、检测方法及分子标志物。一种良好的肿瘤分子标志物至少应该满足三个条件,即肿瘤特异性、敏感性及组织特异性。hMAM基因是应用差异PCR筛选得到的乳腺癌相关基因,对应的编码蛋白属于子宫珠蛋白超家族成员,hMAM在正常乳腺组织中低表达,在其余正常组织中不表达,但是在乳腺癌组织中特异性高表达,具有较好的乳腺组织特异性,因此成为乳腺癌新的分子标志物。目前外周血中乳腺癌CTC分离所采用的方法较复杂,因此乳腺癌患者外周血CTC检测用于肿瘤复发／转移监测的临床应用受限。以外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)代替CTC可以简化CTC复杂的分离流程,提高CTC临床应用的可行性。以PBMC代替CTC应用于乳腺癌检测及监测的研究结果不一,甚至某些研究结果之间差异较大,考虑可能与不同研究所采用的检测方法灵敏度差异有关,也可能与不同研究所采用的分子标志物特异性差异有关。研究显示逆转录实时PCR可以作为CTC简便高效的检测方法。此外,如果在此方法基础之上选择合适的分子标志物,可以提高乳腺癌患者外周血CTC检测的特异性。多数研究显示hMAM mRNA在乳腺癌患者外周血中特异性高表达,在早期乳腺癌诊断中具有重要意义。外周血中hMAM mRNA表达即间接表明乳腺癌CTC的存在。CTC在肿瘤转移过程中是重要的参与者及执行者,因此外周血hMAM mRNA检测可用于乳腺癌复发及转移的监测,尤其可以预测微小转移的发生。此外,由于外周血样本取样简单,并且可实现实时检测(point of care test, POCT),因此在动态监测乳腺癌患者肿瘤转移及预后评估中将具有重要的临床应用价值。目的建立以hMAM作为分子标志物的乳腺癌患者外周血CTC检测方法,证实hMAM mRNA在乳腺癌患者外周血中表达的特异性,并探讨外周血hMAM表达与乳腺癌临床病理学参数的相关性,为hMAM mRNA检测的临床应用奠定实验基础。方法研究对象为安徽医科大学附属省立医院2012年1月至2014年12月期间入院确诊的80例乳腺原发性浸润性癌、39例乳腺原位癌及53例乳腺良性病变患者。75例乳腺原发性浸润性癌患者经术前胸片、肝脏B超、头颅MRI及全身骨扫描等检查均证实未见远处转移。对照组为53例乳腺良性病变。所有患者采集血液前均已经病理学检查证实病变性质,但尚未进行手术切除治疗或化疗。每例患者均按照要求采集外周血,并进行PBMC分离及总RNA提取。SYBR Green RT-PCR检测hMAM mRNA表达,并同步进行电泳分析,以GAPDH作为内对照,以RT-PCR结果及电泳结果综合判断hMAM mRNA表达情况。比较不同乳腺疾病患者外周血中hMAM mRNA表达水平,并分析乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA表达与临床病理学参数(组织学分级、临床分期及淋巴结转移)的关系。采用SPSS 17.0进行数据统计学分析,组间阳性率比较及阳性率与临床病理学参数的相关性分析均采用Pearson's卡方检验方法。P0.05为差异具有统计学意义。结果1. hMAM RT-PCR扩增产物长度为105bp,内对照GAPDH RT-PCR扩增产物长度为154bp。每例样本的GAPDH条带阳性时,认为检测结果可信；样本目的条带信号强度等于或强于GAPDH条带时,判定为阳性。hMAM mRNA在良性乳腺疾病患者外周血中的阳性表达率为0%(0/53),在乳腺原位癌患者外周血中的阳性表达率为51.3%(20/39),而在乳腺浸润性癌患者外周血中的阳性表达率为75.0%(60/80)。外周血中hMAM mRNA表达在良性乳腺疾病与乳腺原位癌之间、良性乳腺疾病与乳腺浸润性癌之间均存在显著性差异(P0.01)。外周血中hMAM表达在乳腺原位癌与浸润性癌之间的差异无统计学意义(P=0.10)。2. hMAM mRNA在组织学分级Ⅰ级、Ⅱ级及Ⅲ级乳腺浸润性癌患者外周血中的表达率分别为75.00%、75.76%及73.91%,其表达与肿瘤组织学分级无相关性(P=0.99)。hMAM mRNA在Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅲ期乳腺浸润性癌患者外周血中的表达率分别为66.67%、68.00%及95.24%,其表达与肿瘤临床分期无关(P=0.28)。hMAM mRNA在腋窝淋巴结转移及未转移乳腺浸润性癌患者外周血中的表达率分别为95.00%及55.00%,其表达与腋窝淋巴结转移相关(P0.01)。结论1. hMAM mRNA在乳腺浸润性癌患者外周血中特异性高表达。2.乳腺浸润性癌患者外周血中hMAM mRNA表达与肿瘤腋窝淋巴结转移相关,而与肿瘤的组织学分级及临床分期无关。3.乳腺癌患者外周血hMAM mRNA SYBR Green RT-PCR检测可以代替CTC检测用于监测肿瘤转移及评估预后。背景乳腺癌是异质性明显的肿瘤,不同分子亚型乳腺癌的发生发展与多种因素有关,因此乳腺癌诊断及治疗相关分子标志物应该较多。然而,目前可用于乳腺癌分子诊断及靶向治疗的标志物有限。这些标志物虽然已经在临床实践中得到广泛应用,但仍存在着一些弊端,如缺乏乳腺组织特异性及缺乏肿瘤特异性,同时由于目前已知的候选标志物数量较少,因此限制了乳腺癌准确分子诊断及有效靶向治疗目标的实现。hMAM是乳腺癌特异性的分子标志物,前期研究表明hMAM蛋白具有分泌特性,由于分泌性蛋白通常会具有细胞膜表达方式,因此应该存在膜相关型hMAM,但是目前尚缺乏足够证据。多数研究也均认为hMAM蛋白仅在乳腺癌肿瘤细胞浆内表达,但有研究通过分析hMAM蛋白的结构,认为MAM蛋白在分泌之后会以膜型方式继续存在,并且也证实hMAM蛋白在乳腺癌细胞表面表达。此外上述研究同时评价了hMAM蛋白作为乳腺癌治疗靶点的可行性,结果显示抗hMAM抗体处理仅能引起有限的肿瘤细胞凋亡。近期则有研究再次证实hMAM蛋白在乳腺癌细胞膜表面有表达,并且显示hMAM可能在乳腺癌迁移及侵袭过程中发挥负调节作用。膜型hMAM蛋白可能通过跨膜蛋白信号转导通路在乳腺癌细胞增殖、浸润及转移中发挥促进或抑制作用。明确膜相关型hMAM的存在及其在乳腺癌细胞增殖中的作用,将为深入研究乳腺癌发生的分子机制提供新方向,同时为乳腺癌靶向治疗提供新靶点,目的明确膜相关型hMAM蛋白的存在,初步探讨膜相关型hMAM蛋白对乳腺癌细胞ZR75-1体外增殖的影响。方法免疫组织化学染色在体内组织水平证实hMAM蛋白的乳腺癌细胞特异性细胞膜表达方式；Western Blot在体外细胞水平证实hMAM乳腺癌细胞表面表达模式。以抗人hMAM抗体处理乳腺癌细胞ZR75-1,并设置无关抗体对照、阴性对照及空白对照,不同时间节点酶联免疫检测仪检测各孔490nm波长吸光度值,MTT法评价细胞增殖活性。采用SPSS 17.0软件进行数据统计学分析,成组资料间的统计学分析采用t检验。P0.05为差异具有统计学意义。结果1.免疫组化染色检测171例乳腺癌组织中hMAM蛋白的表达模式。结果显示克隆号为31A5抗体可特异性识别乳腺组织肿瘤细胞表面的hMAM蛋白。以31A5抗体作为检测抗体,免疫组化染色分析结果显示在食管癌、肝癌、胆囊癌及结肠癌组织中31A5抗体标记结果均为阴性；此外,31A5抗体在人胃、肝、肺及肾脏组织中的标记结果也均为阴性。2.以31A5作为检测抗体,以明确膜表达的Na+-K+-ATPase作为对照, Western Blot结果显示在5株乳腺癌细胞中,MDA-MB-231细胞膜蛋白裂解物中hMAM中等强度表达,而ZR75-1及MDA-MB415细胞膜蛋白裂解物中hMAM弱表达。3.以31A5抗体处理乳腺癌细胞ZR75-1,结果显示,与无关抗体对照、抗体溶媒PBS对照及培养基对照相比,31A5抗体处理乳腺癌细胞ZR75-1后的第3天,肿瘤细胞增殖活性降低(P0.05)；与各对照组相比,其余时间节点未显示细胞增殖活性的变化。各个时间节点各对照组之间相比,细胞增殖活性无显著变化。以MDA-MB-231、MDA-MB415及MCF-7细胞作为检测细胞,与对照组相比,31A5抗体处理后的各时间节点细胞增殖活性无显著变化。结论1.在体内乳腺癌组织及体外乳腺癌细胞中均存在膜相关型hMAM,不同生物学特性乳腺癌细胞中膜相关型hMAM的表达水平不同。2.细胞表面MAM介导的细胞信号转导通路可能在ZR75-1细胞增殖中发挥促进作用,抗MAM抗体可通过阻断该促进作用从而抑制细胞增殖。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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