1、第一部分：MiR-548k基因座拷贝数扩增促进食管鳞癌恶性增殖及淋巴结转移的机制研究 2、第二部分：PCLO在食管鳞

发布时间：2018-05-23 20:30

本文选题：食管鳞癌 + 拷贝数扩增　；参考：《北京协和医学院》2015年博士论文

【摘要】：食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占全球肿瘤发病率的第八位,死亡率占癌症相关死亡率的第六位。根据组织病理类型分类,食管癌可分为两种主要类型：食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)和食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。ESCC在所有食管癌病例中约占90%,而中国是ESCC的高发地区,其中约70%发生在中国。在过去三十年中,食管鳞癌的诊断,分期和治疗水平均有很大的提高。然而,ESCC的长期预后仍然难言乐观,五年生存率只有15%-25%。进一步深入了解食管鳞癌的发病机理、寻找食管鳞癌诊断的分子标志物、确定研发临床治疗的药物靶点以及制定有效治疗方案具有重要的临床意义。本课题通过全基因组测序和比较基因组杂交芯片技术,发现在食管鳞癌样本中,11ql3.3-11q13.4区域存在高频率的扩增现象,而且,该区域内有一个miRNA——miR-548k至今未见其与疾病相关的报道。通过分析,我们发现在该区域拷贝数扩增与淋巴结转移有非常显著的相关性(p0.001)。为了进一步明确miR-548k在食管鳞癌的临床意义,我们对93例食管鳞癌组织标本及其配对癌旁组织标本进行RNA原位杂交实验。结果表明,miR-548k在食管鳞癌中存在过表达并且与生存预后和淋巴结转移相关。进而,我们通过细胞模型和裸鼠模型全面而系统地研究了miR-548k的生物学功能,揭示其具有癌基因特性,能够促进食管鳞癌胞的恶性表型,具体表现为促进细胞增殖,增强克隆形成能力,加速细胞周期G2/M期进展,增强细胞的运动和侵袭能力,促进裸鼠成瘤,增强移植瘤的局部浸润能力和促进细胞发生血行肺转移。新生淋巴管的形成是癌细胞发生淋巴结转移的必要条件。我们研究发现,miR-548k高表达细胞的分泌物能够增强淋巴管内皮细胞HDLEC的迁移能力和成管能力。进一步我们通过裸鼠模型在体研究miR-548k与淋巴管形成之间的关系。实验结果进一步确认miR-548k能够促进裸鼠成瘤并且其对应的膝窝处淋巴结明显大于对照组。免疫组化结果表明,所有实验组及部分对照组的膝窝处淋巴结均发现食管鳞癌细胞转移现象,而且实验组中的染色强度明显高于对照组,同时,实验组移植瘤中不管是瘤体周围或瘤体内部,淋巴管的数目都明显多于对照组。此外,膝窝处淋巴结外围淋巴管的数量也明显多于对照组。分子机制研究表明,miR-548k通过下调细胞周期G2期检测点激酶Weel而加速G2/M期进展,促进细胞增殖。并且,miR-548k能够靶向EGFR的转录抑制因子KLF10,进而上调EGFR的水平,激活EGFR下游Akt和Erk通路,促进食管鳞癌细胞系的恶性增殖和侵袭转移。此外,miR-548k可能通过抑制ADAMTS1的表达而促进淋巴管新生过程。综上所述,本课题首次发现miR-548k在食管鳞癌中具有高频率的拷贝数扩增,并且其过表达与食管鳞癌病人的生存及淋巴结转移密切相关。体外和体内的生物学功能研究表明,miR-548k过表达能够促进食管鳞癌细胞的恶性表型。靶基因研究系统地揭示了miR-548k调控食管鳞癌恶性进展的分子机制,miR-548k通过靶向细胞周期调控因子Weel和转录抑制因子KLF10而调控食管鳞癌细胞的增殖、运动和侵袭等能力,而通过靶向ADAMTS1调控食管鳞癌细胞对淋巴管内皮细胞的趋化以及促进新生淋巴管形成。食管鳞状上皮细胞癌(简称食管鳞癌,ESCC)是在全球范围内尤其是在中国地区最为常见的侵袭性和致死性的恶性肿瘤之一。在中国,食管鳞癌导致的肿瘤相关死亡率占全部肿瘤的第四位。本室前期通过全基因组测序全面而系统地揭示了食管鳞癌的基因组改变情况全景图,该成果使得我们可以从本质上更深入地了解ESCC恶变的基因机制。本研究发现,在所有检测到的基因变异中,PCLO的突变率为15.9%,拷贝数扩增频率为11.4%,是改变最明显的肿瘤相关基因之一。我们进一步研究PCLO的蛋白(Piccolo)水平与ESCC的不同临床病理特征之间的关联性。首先,我们对469对具有详细临床信息的ESCC组织及其癌旁组织的石蜡包埋标本进行了免疫组化实验分析。结果表明,Piccolo在癌组织及转移的淋巴结组织中的表达量高于癌旁组织(p=0.0028)。有意思的是,我们发现Piccolo在肿瘤组织和转移的淋巴结组织中同时过表达(p0.001,rs=0.502),提示Piccolo过表达的病人更容易发生淋巴结转移。癌组织中Piccolo的表达水平与临床分期(p=0.001),病人总生存时间(p=0.008),病人无病生存时间(p=0.004)和瘤栓(p=0.013)之间均显著相关；此外,Piccolo的表达水平与淋巴结转移(p=0.099)和病理分级(p=0.095)之间存在潜在的相关性。值得一提的是,Piccolo过表达与ESCC病人的低生存率(包括总生存和无病生存)显著相关(p=0.001,Kaplan-Meier survival analysis and log-rank test)。Piccolo表达阳性组的5年生存率(47.8%)相对于Piccolo表达阴性组(68.9%)有实质性的降低。对于总生存时间而言,Piccolo表达阴性组的中位生存时间为150个月(95% CI68.136～231.864),而Piccolo表达阳性组的中位生存时间仅为47个月(95%CI34.345～59.655)。对于无病生存时间而言,Piccolo表达阴性组的中位生存时间为141个月(95% CI 82.992～199.008),而Piccolo表达阳性组的中位生存时间仅为37个月(95%CI 27.235～46.765)。单变量Cox回归生存分析也显示Piccolo染色为阳性的病人相比与Piccolo阴性的病人其不良预后的风险更高(总生存HR=1.665,95% CI 1.227～2.25,无病生存：HR=1.618,95% CI 1.208-2.168)。很有意思的是,在T1期ESCC样本,Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验结果显示,Piccolo的过表达与总生存(p=0.004)和无病生存(p=0.004)预后差密切相关。此外,Piccolo过表达的病人出现不良预后的风险相对较高(总生存：HR=2.393,95% CI 1.295-4.424无病生存：HR=2.398,95% CI 1.324～4.341)。多变量Cox回归生存模型分析,结果表明Piccolo的表达水平可以作为独立的生存预后因素(总生存：p0.001,HR=4.77,95% CI 2.129～10.689；无病生存：p0.001HR=4.003,95% CI 1.871to 8.564)。综上所述,Piccolo表达水平可能作为早期ESCC预后的分子标志物。为了进一步明确Piccolo在食管鳞癌恶性进展中的作用,我们通过一系列体外细胞学实验和体内动物模型实验研究发现敲降Piccolo之后能够减弱ESCC细胞的增殖和克隆形成能力,导致ESCC细胞发生G2/M期阻滞,抑制ESCC细胞的侵袭和转移能力,抑制ESCC细胞的裸鼠成瘤和肺转移能力。分子机制研究表明,敲降Piccolo能够促进EGFR内化,并提高EGF R的泛素化水平,导致其分选至晚期内吞小体的数量增多,促进EGFR发生降解。Piccolo能够与E3泛素连接酶Siahl结合并抑制其与EGFR结合,从而稳定EGFR的蛋白水平。进一步的研究发现,Piccolo参与调控的ESCC恶性表型部分依赖于EGFR而起作用的。敲降Piccolo够抑制EGFR下游Akt和Erk通路的活性。异源表达EGFR能够部分恢复由于Piccolo下调而导致的ESCC表型改变。实验中我们观察到Piccolo显示出很强的膜染色现象,这表明了Piccolo是一种膜蛋白,可能成为一个潜在的治疗靶点。我们制备了靶向Piccolo的鼠源单克隆抗体(Piccolo mAb)并验证了Piccolo mAb具有一定抑制细胞增殖和裸鼠移植瘤形成的效果。总之,本研究首次从基因、临床、功能、机理和治疗的等不同层面上,广泛而深入地揭示Piccolo通过介导EGFR信号通路在食管鳞癌恶性进展中发挥的作用,并阐明其有可能成为食管鳞癌的潜在预后分子标志物和治疗新靶点。细胞在进化中形成一套精密的调控网络来进行DNA损伤应答和修复,通常称为DNA损伤修复应激系统(DNA damage response,DDR).-旦DDR系统感知细胞基因组遭受到攻击,信号就会发生级联传递下去,从而促进修复损伤的DNA。p53是重要的抑癌基因,处于肿瘤相关的应激反应复杂调控网络的核心,可保证细胞周期的正确运行,促进DNA修复,诱导细胞凋亡,在维持基因组稳定性方面发挥着重要的作用。许多与p53相关的microRNA(miRNA)在DNA损伤修复应激系统中发挥着至关重要的作用。本研究中,我们利用miRNA表达谱芯片检测UV-C照射之后0h.4h.8h和12h时间点HCT116 p53+/+细胞和HCT116 p53-/-细胞中miRNA的表达情况。分析结果表明,在HCT116 p53+/+细胞或HCT116 p53-/-细胞中,照射之后4h与没有照射相比较,两种细胞系中发生应激而表达水平发生改变的,niRNAs在数量上差别不大,并且以表达下调为主。这些结果提示,在DNA损伤应激早期,细胞可能通过迅速降解部分miRNAs而上调其靶基因的水平来对损伤进行快速应答。而且,UV-C诱导的DNA损伤应答可能与p53的状态(有/无)有关系,因为在HCT116 p53+/+细胞或HCT116 p53-/-细胞中发生差异表达的miRNAs并不一样。很有意思的是,我们发现UV-C照射之后不同时间点发生变化的miRNAs在HCT116 p53+/+细胞中主要以下调为主,而在HCT116 p53-/-细胞中却有很多上调的miRNAs.另外,UV-C照射之后随着时间的进展,HCT116 p53-/细胞中因应激而发生差异表达的miRNAs越来越多；而在HCT116 p53+/+细胞中,8h这个时间点上发生变化的miRNAs最多,而4h和12h时候都相对比较少。另外,我们通过比较不同时间点上HCT116 p53+/+细胞和HCT116 p53-/-细胞的差异,寻找跟p53相关的miRNAs.结果表明,HCT116 p53+/+田胞相对于HCT116 p53-/-细胞,在UV-C照射之后4h时间点上,有许多miRNAs表达上调,在随后的时间点上,其中有部分miRNAs相继表达下调。这提示在DNA损伤应答的早期,p53上调一些miRNAs参与相关应答。从这些结果中,我们可以发现,UV-C导致的DNA损伤修复应答过程中,许多miRNAs是以动态的方式参与调控的,其中有些可能是依赖于p53的转录功能。进一步分析发现有大约50%(59/120)的差异表达miRNAs具有p53-DNA结合motif.我们应用超几何分布模型研究发生差异表达的miRNAs在染色体的定位分布,结果显示定位于第13/17号染色体和X染色体的miRNAs相对于其它染色体上的miRNAs参与DNA损伤应答的可能性较高。我们利用在线miRNAs分析系统MiRSystem来预测这些差异表达miRNAs的功能和所介导的信号通路,结果发现在UV-C诱导DNA损伤应答过程中,MAPK通路也是一条受到影响最多的通路之一。此外,Wnt通路、黏附通路(Focal Adhesion Pathway)和p53通路也被富集到参与UV-C诱导的DNA损伤应答中。最后,我们还研究了其中一个miRNA——miR-320a的功能,发现miR-320a有利于细胞在遭受DNA损伤之后的存活。综上所述,本课题动态研究了UV-C照射导致细胞发生DNA损伤应激情况下miRNAs的变化情况,新发现了许多参与DNA损伤应答相关的iRNAs,这为后续研究miRNAs口何参与调控DNA损伤应答提供了数据基础。由于很多结肠癌患者中存在DNA损伤应答通路缺陷,本研究能够为更好理解结肠癌的发病机制及进展提供一定的理论基础。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1

【参考文献】