PC4调控非同源末端连接修复在非小细胞肺癌放疗中的作用及其机制研究

发布时间：2018-05-28 06:12

  本文选题：PC4 + 非同源末端连接　； 参考：《天津医科大学》2017年博士论文

【摘要】：目的:观察转录辅助因子4(PC4)调控非同源末端连接修复在非小细胞肺癌放疗中的作用,初步探讨其产生作用的发生机制。方法:实验选取了4组不同的非小细胞肺癌细胞系进行研究,采用四质粒共转染方法转染293FT细胞,从而获得慢病毒颗粒,经过嘌呤霉素筛选,成功的构建A549、PC-9干扰PC4表达、恢复PC4表达以及空载对照的稳定株细胞(sh PC4、sh PC4+PC4、Mock)。设置0-8Gy(分别为0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)梯度剂量照射细胞。采用平板克隆实验,检测细胞在接受不同辐射剂量照射后,克隆形成能力的变化情况;采用流式细胞术,检测PC4不同表达状态下,细胞接受辐射之后出现凋亡率变化的情况;Western Blot及PCR法观察PC4对非同源末端连接(NHEJ)相关蛋白XLF、XRCC4、DNA LigaseⅣ表达的影响;利用免疫荧光技术,观察XLF与DNA双链断裂(DSB)共定位能力的变化及对其修复的影响;利用免疫共沉淀法(IP),检测PC4与XLF相互作用及变化情况;通过染色质免疫共沉淀法(CHIP),检测PC4与XLF启动子结合能力的变化。结果:相较于支气管上皮细胞Beas-2B而言,PC4在A549、PC-9、H1975、H460四组非小细胞肺癌细胞中高表达。干扰PC4的表达后,A549和PC-9细胞的克隆形成率降低,辐射敏感性提高,恢复PC4的表达后,细胞的克隆形成率也随之升高,细胞对于辐射的敏感性下降。进一步的研究发现,干扰了PC4的表达后,辐射引起的细胞凋亡增加,此外,抑制了PC4表达后,XLF表达下降,且PC4与XLF的相互作用减少,而XRCC4以及DNA LigaseⅣ的表达未见明显变化。免疫荧光结果显示:细胞接受照射后,sh PC4组的XLF表达降低,同时DNA双链断裂修复减少,恢复PC4表达后,XLF表达以及DSB修复都得到了恢复。IP及CHIP结果显示:PC4在转录水平调控XLF的表达,敲低PC4表达后,PC4与XLF的相互作用减少。结论:下调PC4可在转录水平抑制XLF的表达,通过减少非同源末端连接修复增加了辐射引起的凋亡,从而增强了非小细胞肺癌细胞的辐射敏感性,PC4可能通过参与NHEJ影响细胞对辐射的敏感性。
[Abstract]:Aim: to investigate the role of transcription cofactor 4 (PC4) in regulating the repair of nonhomologous terminal junctions in radiotherapy of non small cell lung cancer (NSCLC). Methods: four different groups of non-small cell lung cancer cell lines were selected and four plasmids were co-transfected into 293FT cells to obtain lentivirus particles. After purine mycin screening, A549 PC-9 interference PC4 expression was successfully constructed. The expression of PC4 was restored, and the stable cell line of no-load control, shPC4nsh PC4 PC4Mockanus, was restored. The cells were irradiated with a gradient dose of 0 ~ 8 Gy (0 Gy ~ 2 Gy ~ 4 Gy ~ 6 Gy ~ 8 Gy). The colony forming ability of cells was detected by plate cloning assay after irradiation with different doses of radiation. Flow cytometry was used to detect the expression of PC4 in different states. The changes of apoptosis rate after irradiation were observed by Western Blot and PCR to observe the effect of PC4 on the expression of XRCC4DNA Ligase 鈪，

本文编号：1945623