氧化应激介导地高辛诱导的肺癌细胞死亡

发布时间：2018-05-29 02:14

  本文选题：地高辛 + 氧化应激　； 参考：《河北医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：目的:洋地黄类药物是临床治疗心律失常和心力衰竭的常用药物,地高辛是临床上常用的洋地黄类药物之一,流行病学实验证实,服用洋地黄类药物的患者复发率和死亡率均较低。实验室的数据也证实,洋地黄类药物可明显抑制多种肿瘤细胞的生长。近年来,氧化应激在药物抗肿瘤中的作用受到广泛关注,活性氧可氧化肿瘤细胞中核酸和蛋白质等大分子物质,引起细胞损伤,也可作为信号分子参与细胞内信号转导,调控细胞生长增殖。很多抗肿瘤药物通过诱导活性氧(ROS)的升高杀伤肿瘤细胞。本实验中,我们拟研究氧化应激在地高辛抗肿瘤中的作用,并进一步探讨活性氧的来源以及其作用途径。方法:采用MTT比色法检测地高辛对细胞增殖的影响,用DCFH-DA和dihydroethidium探针标记检测细胞内活性氧和超氧阴离子的变化,用JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位变化。用丙二醛(MDA)、谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶活性试剂盒检测细胞内相应物质含量或活性变化。用流式细胞术、电镜和PI染色检测地高辛诱导细胞坏死的作用。用吖啶橙(AO)染色检测自噬溶酶体的形成。采用彗星实验检测地高辛诱导的细胞DNA损伤。用Western blot检测p-H2A.X蛋白表达。结果:1地高辛对不同细胞生长的抑制作用我们检测了地高辛对不同细胞生长的抑制作用,其中对A549细胞和HCC827细胞的抑制作用最为明显,作用24h对A549细胞生长的IC50为0.21μmol/L。对HCC827细胞的IC50为0.26μmol/L,对TE-1细胞的IC50为1.12μmol/L,对MCF-7细胞和BGC-823细胞作用最差,对MCF-7细胞和BGC-823细胞的IC50为9.18μmol/L和37.14μmol/L。2地高辛通过诱导活性氧升高抑制A549细胞生长地高辛可明显诱导A549细胞活性氧及超氧阴离子升高,并且随作用时间延长,活性氧含量及超氧阴离子含量逐渐增加,活性氧的升高可引起线粒体膜电位的降低。N-乙酰半胱氨酸(NAC)可完全拮抗地高辛引起的活性氧和超氧阴离子升高及地高辛的抗肿瘤作用,GSH也可部分拮抗地高辛引起的A549细胞死亡(P0.05或0.01 vs地高辛)。同等浓度的地高辛仅引起TE-1细胞活性氧的轻度升高,不能引起MCF-7细胞和BGC-823细胞活性氧的升高,这与地高辛对这几种细胞的生长作用一致。地高辛引起的活性氧的升高早于细胞内钙升高,因此,地高辛引起的活性氧的升高并不是由于细胞内钙升高引起的。0.2μmol/L地高辛可抑制细胞生长,但对肿瘤细胞Na+/K+-ATPase活性没有影响,因此,地高辛抑制肿瘤生长作用可能与Na+/K+-ATPase没有关系。3地高辛诱导A549细胞活性氧的升高来源于线粒体和NADPH氧化酶两条途径地高辛可引起A549细胞MDA含量明显增加(P0.01),GSH/GSSG比值明显降低(P0.01 vs对照),NADPH氧化酶活性增高(P0.01 vs对照)。NADPH氧化酶抑制剂二联苯碘(DPI),线粒体抑制剂鱼藤酮和电子传递链复合体Ⅰ阻断剂环孢素A(Cs A)可拮抗地高辛的抗肿瘤作用(P0.05或0.01 vs地高辛)。这些结果提示,活性氧的升高来自线粒体和NADPH氧化酶两条途径。4坏死与自噬参与了地高辛诱导的A549细胞死亡流式和PI染色结果显示地高辛可诱导细胞坏死率明显增加(P0.01 vs对照),Hoechest33342染色结果显示地高辛组细胞的细胞核没有出现凋亡细胞特有的浓缩,而是呈现空泡化。电镜下可见地高辛组细胞核膜破裂,细胞器溶解,呈现典型的坏死特征。坏死抑制剂necrostatin-1可显著拮抗地高辛的作用(P0.05或0.01 vs地高辛),而凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和Ac-DEVD-CHO对地高辛的抗肿瘤作用没有影响。吖啶橙染色的结果显示地高辛可诱导A549细胞自噬溶酶体明显增多,自噬抑制剂3-MA可部分拮抗地高辛的抗肿瘤作用。5地高辛可诱导ROS升高引起A549细胞DNA损伤彗星实验的结果显示,地高辛可诱导细胞出现明显的拖尾DNA(P0.01 vs对照),免疫组化实验及western blot结果均显示,地高辛可诱导DNA损伤标志物p-H2A.X表达逐渐增加。NAC可拮抗地高辛的作用(P0.01 vs地高辛)。6地高辛通过诱导活性氧升高引起HCC827细胞坏死和自噬地高辛可诱导HCC827细胞活性氧升高,且NAC可拮抗地高辛升高活性氧的作用,也可拮抗地高辛的抗肿瘤作用,提示地高辛诱导的活性氧的升高参与了其诱导的HCC827细胞的死亡(P0.01 vs对照)。地高辛也可诱导HCC827细胞NADPH氧化酶升高,且DPI、Cs A和鱼藤酮均可拮抗地高辛的抗肿瘤作用(P0.05或0.01 vs地高辛),提示地高辛诱导的HCC827细胞活性氧的升高同样来自线粒体和NADPH氧化酶两条途径。流式细胞仪和电镜的结果显示,地高辛可诱导HCC827细胞坏死率明显增加(P0.01 vs对照),NAC和necrostatin-1可阻断地高辛的作用(P0.05或0.01 vs地高辛)。地高辛也可诱导HCC827细胞自噬溶酶体增加,且自噬抑制剂3-MA也可拮抗地高辛的作用(P0.05或0.01 vs地高辛)。结论1地高辛对不同肿瘤细胞生长抑制作用有明显的选择性,对A549细胞和HCC827细胞作用较强。2地高辛通过线粒体和NADPH氧化酶两条途径诱导肿瘤细胞活性氧明显升高。3地高辛通过诱导活性氧的升高引起肿瘤细胞DNA损伤、坏死和自噬。
[Abstract]:Objective : To study the effect of digoxin on cell proliferation in vitro and to explore the effect of digoxin on cell proliferation . In recent years , the inhibitory effect of digoxin on cell proliferation was investigated . The increase of active oxygen induced by digoxin was not related to the growth of Na + / K + - ATPase . The inhibitor of NADPH oxidase inhibitor ( DPI ) , mitochondrial inhibitor and electron transport chain complex 鈪，

本文编号：1949106