骨桥蛋白促进肝癌细胞顺铂耐药的实验研究

发布时间：2018-05-30 09:45

本文选题：肝细胞癌 + 顺铂耐药　；参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景和目的：原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,大部分患者就诊时较晚,已出现播散转移,失去手术机会,即使手术切除,术后复发率也高达60%-70%。另外一个重要的治疗手段是化疗,但是治疗期间出现的对化疗药物耐药的问题非常突出。尽管目前原发性肝癌的临床和基础研究取得了较大的进展,然而其耐药机制尚未完全阐明。肝癌的耐药是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程,个体差异大。因此,寻找一个有效的耐药预测及干预靶点是目前研究的重心。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种亲水性的分泌型钙结合磷酸糖蛋白,因为从骨基质中分离得到,故而得名。OPN是一种多功能的细胞因子,参与细胞的存活、迁移和黏附。越来越多的证据阐明了其在肿瘤发生、发展和转移中的作用。人类OPN基因定位4号染色体,q13位点,OPN基因经过转录、翻译,最终合成的蛋白包含314个氨基酸组成。OPN功能复杂,参与多种生理、病理过程：这些过程包括骨的重塑、血管生成、组织细胞的损伤修复、动脉粥样硬化等。研究发现,OPN与多种肿瘤的发生、发展密切相关。其在前列腺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤中表达水平增高。OPN通过与自身受体整合素、CD44分子结合,参与肿瘤细胞的信号传导过程,促进细胞的趋化及迁移,介导癌细胞的侵袭、转移。因此,肝癌的复发转移与OPN有关。然而,OPN对人肝细胞癌(HCC)化疗产生耐药性的影响尚未阐明。材料与方法：本研究纳入原发性肝癌患者就诊于华中科技大学同济医院,均行TACE治疗,术前均未接受手术治疗。搜集临床资料包括患者的姓名、性别、年龄、肝炎病毒感染状态等,临床分期(TNM分期)按照2002年国际抗癌联盟(UICC)第六次修订的TNM分期标准,肝细胞肝癌病理分级依据Edmondson标准。本组8例患者均获得TACE术前及术后的病理切片,通过HE染色和SP法免疫组化,进行自身对照,比较OPN表达在TACE治疗前后有无差异性。人肝癌细胞株HepG2、Huh-7和PLC/PRF/5培养在含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM培养基中,细胞放置于37℃、5%二氧化碳和95%的空气的培养箱中培养。肝癌细胞对顺铂的敏感性利用细胞毒性实验和流式细胞仪分析。采用实时定量PCR检测顺铂处理前后三种肝癌细胞系的OPN mRNA表达水平。采用Western blot检测顺铂处理前后三种肝癌细胞系的OPN蛋白表达水平。采用Western blot检测磷酸化及总PI3K、磷酸化及总AKT、Caspase-3蛋白表达量。在培养基中添加OPN,检测不同组细胞对于顺铂的敏感性,描绘顺铂毒性曲线,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。通过CD44抗体、αvβ3抗体和PI3K/AKT通路抑制剂LY294002,阻断OPN通路,观察细胞凋亡比率,反应顺铂耐药情况。每组实验至少独立进行三次,结果采用平均数±标准差描述,采用方差检验及t检验进行统计推断,P0.05被认为有统计学意义。结果：1.结果表明,OPN在顺铂化疗后的肝癌组织标本中表达量明显增加。2.顺铂处理后的HepG2、HuH-7及PLC/PRF/5细胞中OPN在转录水平得到显著提高。与此相符,采用Western Blot法检测OPN蛋白水平同样发现OPN表达水平在顺铂处理后得到显著提高。PI3K/AKT信号通路被顺铂激活并且这种效应是通过依赖OPN通路实现的。观察到OPN处理后的HepG2、HuH-7及PLC/PRF/5细胞的顺铂毒性曲线上移,表明其对顺铂的敏感性降低,耐药性增强。OPN组细胞经顺铂处理后显著下调Caspase3的激活水平,提示凋亡水平显著下调。3.与此相反,利用CD44抗体、αvβ3抗体和LY294002阻断OPN通路则增加了肝癌细胞对顺铂的敏感性。结论：综上所述,OPN通过激活PI3K/AKT信号通路使肝癌细胞对顺铂的耐药性增强,所以,阻断OPN通路可能是克服肝癌化疗耐药的新方法。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : Primary liver cancer ( HCC ) is one of the most common malignant tumors in our country , with high degree of malignancy . Results : 1 . The results showed that the sensitivity of tumor cell line HepG2 , HuH - 7 and PLC / PRF / 5 was significantly increased by Western blot .
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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