CIK细胞对肝癌干细胞的杀伤作用及其相关机制研究

发布时间：2018-05-31 03:00

本文选题：原发性肝癌 + 细胞因子诱导的杀伤细胞　；参考：《南方医科大学》2015年博士论文

【摘要】：背景和目的原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,其起病隐匿、且发展迅猛,我国每年死于原发性肝癌的患者约11万例数,其死亡率已上升为农村和城市恶性肿瘤死亡率的第一位和第二位。在我国,肝癌的诱发因素主要为乙型肝炎病毒感染,约有80%-90%的肝癌患者携带乙型肝炎病毒,其余诱发因素包括丙型肝炎病毒感染、酒精肝及黄曲霉素等。目前,手术切除仍然被认为是根治HCC的重要手段之一。然而,大部分HCC患者诊断时已属于中晚期,统计结果表明HCC患者中仅有约15%的患者适合行手术切除治疗。且较之其他恶性肿瘤,HCC存在其特殊的生物学行为,包括肝硬化背景、多中心癌前病变的存在、早期即能侵犯门静脉及发生肝内转移等。在合并肝硬化肝脏功能储备下降的情况下,患者往往难以承受外科手术；且针对肝内多发病灶的情况,外科手术难以对病灶一一切除,上述原因大大的限制了外科手术在HCC中的应用。因此,近年来以经动脉导管栓塞化疗(Transcatheter aterial chemoembolization, TACE)和射频消融(Radiofrequency Ablation)等为代表的微创治疗越来越受到人们的关注。与传统外科手术相比,微创治疗能够最大限度的保存正常肝脏组织同时达到治疗肿瘤的目的。目前,TACE序贯消融治疗联合多吉美靶向治疗已成为治疗肝癌的基本模式。然而,尽管微创治疗在一些早期肝癌的治疗中取得了长足的进步,HCC的5年生存率并没有得到明显的改善,大部分患者在接受外科手术、射频消融等根治性治疗后往往出现肿瘤复发、转移。正如其他肿瘤一样,HCC中似乎也存在着一小部分具有不定向分化和自我更新能力的干细胞,即肿瘤干细胞。国外学者Reya等早年间提出肿瘤干细胞的观点,认为肿瘤通常由正常的干细胞转化而来,且这部分细胞往往对放化疗不敏感,是肿瘤发生复发、转移的根源。因而,寻找能针对靶向肿瘤干细胞的治疗是提高患者手术疗效,延长患者生命的关键。为了更进一步的研究肿瘤干细胞的特性并将其作为一个未来靶向治疗的靶点,肿瘤干细胞的分离及鉴定成为了一个重点。近几年来,关于肝癌干细胞标志物的报道逐渐增多,其中包括CD133、EpCAM、CD13、CD4、CD90、CD24等。尽管从各个实验室分离得到的带有这些标志物的细胞都具有相似的干细胞特性,但目前尚未有公认的肝癌干细胞标志物。Nanog基因是一种在内细胞团、原始生殖细胞以及胚胎干细胞表达的转录因子。近年来发现,Nanog基因不仅在维持胚胎干细胞的全能型方面起着重要作用,而且在多种肿瘤中均有表达,其中包括乳腺癌、膀胱癌、脑胶质瘤等。且Nanog还是一个预后预测因子,Nanog表达越强,则临床预后越差。研究发现Nanog不仅在多种肿瘤于细胞中表达,且还是维持肿瘤干细胞自我更新能力及多向分化潜能的重要因子。国内学者shan等利用Nanog启动子携带外源性GFP报告基因的慢病毒载体分离得到了一小群Nanog阳性的肝癌细胞,并证实了这部分细胞具有干性的特征,包括干性基因的上调及自我更新能力等。因此,我们借鉴这种方法并构建了LV-PNanog-GFP-T2A-Luc慢病毒载体,借此在体内外实验中能更直观的观察肝癌干细胞。近年来,免疫治疗的快速发展给肿瘤治疗带来了曙光。其中,细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer cells, CIK cells)能在体外大量扩增,具有强大的抗瘤效应。CIK细胞是由人外周血单个核细胞(PBMC)在体外经多种细胞因子(包括CD3单抗、IL-2、IFN-γ等)刺激扩增后得到的一群异质性细胞,其主要的效应细胞为CD3/CD56双阳性细胞,因为同时具有T细胞及NK细胞的表型特征,它又被成为NK细胞样的T淋巴细胞。较之其他过继性免疫治疗,CIK细胞体外增值速度快,且具有非MHC限制性杀瘤特点,已在临床上得到广泛的运用。目前,CIK细胞过继性免疫治疗已被综合运用于肿瘤治疗当中,特别是在临床上评价肿瘤达到CR (Complete response)或在肿瘤根治性手术后。在肝癌的临床应用中,已有文献报道CIK联合手术或者微创治疗能显著提高患者生存率、降低肿瘤术后复发率。众所周知,肿瘤干细胞是肿瘤复发、转移的根源。然而,CIK细胞是否通过杀伤肝癌干细胞从而降低肝癌术后复发率却不得而知,且CIK细胞免疫治疗降低肝癌术后复发率的相关机制均未见文献报道。本文旨在探讨CIK细胞对肝癌干细胞的影响及其机制,为CIK联合微创及手术治疗提供坚实的理论基础。方法第一部分CIK细胞培养体系建立及体外抑瘤活性探讨1.健康成人外周血中单个核细胞(PBMC)的分离,采集健康成人新鲜血液后利用淋巴细胞分离液将其分离。依次加入不同的细胞因子包括抗CD3单抗、IFN-γ、PHA以及IL-2等进行扩增、培养；2.CIK细胞的表型检测,收集不同天数的CIK细胞,孵育针对不同细胞表型的流式荧光抗体后利用流式细胞仪检测其表面标志；3.CCK8实验检测培养成熟的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效应；4.平板克隆实验检测CIK细胞对肿瘤细胞增殖能力的影响；5. Transwell及Boyden小室实验检测CIK细胞对肿瘤细胞迁移、侵袭能力的影响；6.肿瘤成球实验检测CIK细胞对肿瘤细胞成球能力的影响；7.统计分析该部分使用GraphPad Prism5进行绘图,采用SPSS20.0软件对实验结果进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。两组样本均数比较采用两独立样本t检验(Two sample t-test),若方差不齐,则采用校正t检验法。多组样本均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若方差齐不性,则采用Walch法进行校正,对照组与实验组的的多重比较采用Dunnett test。以P0.05认为有统计学差异。第二部分CIK细胞对肝癌干细胞的杀伤作用探讨1.构建LV-PNanog-GFP-T2A-Luc质粒2.质粒提取、纯化3.稳定细胞株建立将pMD2.G、psPAX2和目的质粒共同转染293T细胞,生产慢病毒,感染肝癌细胞,建立稳定携带PNanog-GFP-T2A-Luc的肝癌细胞株。4.流式细胞仪分析GFP阳性细胞的比例,小动物活体成像仪体外检测Luc信号5.流式细胞仪分选出GFP阳性及GFP阴性的肿瘤细胞。5.提取GFP阳性及GFP阴性肿瘤细胞的RNA,按照按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书,逆转录成cDNA后,qRT-PCR检测干性相关基因表达水平。6.通过平板克隆实验、成球能力分析及Transwell及Boyden小室实验鉴定GFP阳性细胞干性特征。7.CCK8实验比较CIK细胞对GFP阳性及GFP阴性的肿瘤细胞的杀伤效率。8. Time-Lapse实验直观观察CIK细胞与肿瘤细胞及肿瘤球之间相互作用的过程。9. NOD/SCID小鼠皮下成瘤实验。10.小鼠成瘤后,每两天予以不同比例CIK细胞治疗,同时游标卡尺检测肿瘤体积、小动物活体成像仪检测Luc信号变化。11.组织层面上检测瘤组织中CIK细胞相关CD5、CD56分子的表达。12.免疫组化检测瘤组织增殖相关指标BrdU、Ki67及干性相关指标GFP的表达。13.统计学分析该部分使用GraphPad Prism5进行绘图,采用SPSS20.0软件对实验结果进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。两组样本均数比较采用两独立样本t检验(Two sample t-test),如果对照组为常数,则采用单样本t检验(One sample t-test),若方差不齐,则采用校正t检验法。多组样本均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若方差齐不性,则采用Walch法进行校正,对照组与实验组的的多重比较采用Dunnett test。小鼠治疗期间Luc信号检测和肿瘤体积的比较的采用重复测量设计资料的方差分析。以P0.05认为有统计学差异。第三部分CIK细胞杀伤肿瘤干细胞相关机制探讨1.NKG2D阻断实验CIK细胞与肿瘤细胞共培养前使用NKG2D抗体进行阻断封闭30分钟后,再与肿瘤细胞相互作用,后续相关平板克隆、CCK8、肿瘤成球培养等验证NKG2D分子的功能。2.TUNEL检测细胞凋亡肿瘤细胞与CIK细胞按一定比例共培养4小时后,PBS漂洗去多余的CIK细胞,再按凯基TUNEL试剂盒说明行TUNEL检测。3. ELISA检测CIK细胞释放的细胞因子将肿瘤细胞与CIK细胞按1：10的比例共培养24小时后,留取培养上清以ELISA方法检测细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10等。4.统计学分析该部分使用GraphPad Prism5进行绘图,采用SPSS20.0软件对实验结果进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。多组样本均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若方差齐不性,则采用Walch法进行校正,样本均数间的多重比较采用LSD法；如方差不齐,多重比较采用Dunnett's T3法。CIK细胞杀伤GFP阳性肿瘤细胞效应的比较采用析因设计资料的方差分析。以P0.05认为有统计学差异。结果第一部分CIK细胞培养体系的建立及体外抑瘤活性探讨1.CIK细胞的诱导扩增及表型检测健康成人外周血单个核细胞经过多种细胞因子共同刺激后,于3天后细胞开始形成集落。随着培养时间延长,细胞数量迅速增加,而且集落增多、增大,在此过程中,细胞体积开始增大。经过2周的培养时间后,CIK细胞数量可达到8×108左右,细胞计数较培养前扩增约50倍左右,培养过程中台盼蓝染色检测活细胞比例均在95%以上。我们通过流式细胞仪监测不同天数CIK细胞表型,随着培养天数增加,CIK细胞主要效应细胞CD3/CD56双阳性细胞比例显著增加,由第七天4.7±2.5%到第21天增加至55.2±13.2%。同时,CD8阳性细胞比例也显著增加(D7：69.1±5.1%D21：92.1±2.9%),而CD4阳性细胞比例则逐渐减少(D7：25.6±4.7%；D21：2.7±1.0%)。我们还检测了CIK细胞表面NKG2D分子的表达,NKG2D分子由第七天73.1±3.0%到第21天增加至92.1±2.9%。2.CIK细胞能够明显抑制肝癌细胞增殖CCK8实验结果显示,CIK细胞对肿瘤细胞具有明显的抑制作用,且随着CIK作用比例升高,其抑制作用更明显,其抑瘤率在1：5时为58.3±1.5%(SMMC7721)和67.3±2.5%(Huh7),而在1：50时升高至86±2.0%(SMMC7721)和94±2.0%(Huh7)。平板克隆实验显示,在1：5,1：10,1：30三个比例作用后,两个细胞株克隆形成能力分别下降了45%,72.9%,92.4%(SMMC7721)和43.4%,80%,92.2%(Huh7)。方差分析显示具有统计学差异(F=59.644,P0.001；F=65.519,P0.001)。3.CIK细胞处理后,肝癌细胞迁移、侵袭能力下降,且成球能力下降CIK细胞不止抑制肿瘤细胞增殖,我们还发现CIK细胞处理过后的肝癌细胞迁移侵袭能力及成球能力均有一定的下降。Transewell及Boyden小室实验显示,与CIK细胞共培养24小时后,肝癌细胞的迁移能力分别下降了83.5%(SMMC7721)和58.1%(Huh7),而侵袭能力下降了58.7%(SMMC7721)和82%(Huh7),两独立样本t检验显示具有统计学差异(t=6.945,P=0.001;t=6.743, P0.001; t=13.6635 P0.001; t=8.265, P=0.001)(表1-2,图1-5)。而同时通过肿瘤球培养,CIK处理后的肝癌细胞成球能力也有一定程度的下降,在1：10和1：30两个比例时,其成球能力分别下降了36.8%,87.2%(SMMC7721)和40.9%,89.2%(Huh7),方差分析显示具有统计学差异(F=81.214, P0.001; F=70.813, P0.001)。第二部分CIK细胞对肝癌干细胞的杀伤作用探讨1.稳定表达LV-PNanog-GFP-T2A-Luc的肝癌细胞株的建立及其干性鉴定为了进一步验证CIK细胞对肝癌干细胞的杀伤活性,我们构建了LV-PNanog-GFP-T2A-Luc慢病毒载体。建立稳定HCC细胞株后,通过流式细胞仪检测两个稳定细胞株SMMC7721及Huh7 GFP阳性细胞比例分别约为5.3%及3.9%(图2-1B)。同时,我们还利用小动物活体成像仪检测SMMC7721细胞株Luc信号,在104水平可检测到Luc信号表达,且与细胞数量呈正相关。建立稳定细胞株后,我们通过qRT-PCR方法检测了常见的干细胞相关基因,发现GFP阳性细胞干性基因表达明显上调,包括Nanog, Oct4, Sox2,两独立样本t检验显示具有统计学差异(P均小于0.05)。接下来,我们对分选出来的GFP阳性细胞进行成球能力分析。发现GFP阳性细胞具有更强肿瘤成球能力,其成球能力是GFP阴性细胞的2.6倍左右,两独立样本t检验显示具有统计学差异(t=13.714,P0.001)。而同时通过Transwell和Boyden小室实验,我们发现GFP阳性细胞具有更强的迁移、侵袭能力,两独立样本t检验显示具有统计学差异(t=14.442, P=0.004; t=6.189, P=0.003)。而克隆形成实验也得到相符的结果,GFP阳性细胞的克隆形成能力约为GFP阴性细胞的2.5倍(t=10.575；P=0.00)。通过体外实验,我们发现GFP阳性的肿瘤细胞干性基因表达上调,具有更强的肿瘤成球能力、迁移侵袭能力及克隆形成能力。2.CIK细胞体外杀伤GFP阳性细胞及肿瘤球再对GFP阳性细胞功能做了初步验证后,我们利用CCK8实验验证了CIK细胞对GFP阳性及GFP阴性细胞之间的杀伤效应,结果发现,CIK细胞对两者杀伤效率并无明显差异(F=0.201, P=0.66; F=0.465, P=0.505)。为了更进一步动态观察CIK细胞与肿瘤细胞、肿瘤球之间作用的过程,我们使用Time-Lapse技术拍摄了相关的视频。随着拍摄时间延长,肿瘤细胞(包括GFP阳性细胞)由于趋化作用周围CIK细胞逐渐增多,最后被CIK细胞包围并攻击,形成细胞团块。而在CIK细胞与肿瘤球相互作用的视频中可见,肿瘤球由一开始规则、圆润的球体,逐渐被CIK细胞攻击、吞噬,最后被CIK细胞裂解,而且其绿色荧光信号逐渐减弱。通过体外杀伤实验及视频结果,我们初步证实了,CIK不仅能够杀伤普通肿瘤细胞,而且其对以GFP阳性为代表的肿瘤干细胞也具有一定的杀伤作用。3.CIK细胞体内杀伤GFP阳性细胞为了更进一步验证CIK细胞对肿瘤干细胞的杀伤作用,我们利用携带LV-PNanog-GFP-T2A-Luc的肝癌细胞株SMMC7721行皮下成瘤后使用不同比例CIK细胞治疗小鼠。结果显示大剂量CIK细胞治疗组小鼠肿瘤体积较空白对照组显著降低(P0.05),且瘤重显著降低(F=4.615,P=0.027)。通过小动物活体成像,我们发现,与空白对照组相比,CIK细胞治疗组较空白对照组Luc信号显著降低,重复测量设计资料的方差分析显示组间有显著差异(F=17.206,P0.001),第9天开始,CIK细胞治疗组Luc信号较空白对照组显著降低(P0.05)。Luc信号强度间接反应着肿瘤内干细胞含量,CIK细胞治疗能显著降低Luc信号,预示着CIK细胞治疗在小鼠体内对干细胞也有一定的杀伤效应。我们取材后通过免疫组化对以上结论进行进一步的验证。首先,通过CIK细胞表面特异性的标志CD5、CD56染色,我们证实了CIK细胞确实到达了瘤体。而后,通过免疫组化实验我们发现CIK细胞治疗组增殖相关指标BrdU、Ki67标记阳性细胞比例均较空白对照组下降(F=1065.06, P0.001; F=387.165,P0.001)。且GFP阳性细胞比例较空白对照组显著下降(F=39.857,P=0.004),说明CIK细胞在小鼠体内不仅能抑制肿瘤增殖,还对肿瘤干细胞具有一定的杀伤作用,这与Luc信号检测结果相符。第三部分 CIK细胞对肝癌干细胞的杀伤机制探讨1.NKG2D受体阻断后,CIK细胞对GFP阳性细胞杀伤效应下降,且肿瘤细胞增殖、成球能力回复通过CCK8杀伤实验,我们发现使用抗体将CIK细胞表面的NKG2D配体封闭后,CIK细胞杀伤GFP阳性肿瘤细胞效应显著下降。析因设计资料的方差分析显示不同分组间具有显著差异(F=24.953,P0.001; F=46.369, P0.001).克隆形成实验及肿瘤成球实验显示,使用抗体阻断CIK细胞表面NKG2D分子后,肿瘤细胞的克隆形成能力及成球能力均得到一定的回复,单因素方差分析显示具有统计学差异(F=22.282, P=0.002; F=31.903, P=0.001); (F=16.884, P=0.003; F=17.889, P=0.003)。2.CIK细胞诱导肿瘤细胞发生凋亡通过TUNEL检测,我们发现在经过CIK细胞处理4个小时后,肿瘤细胞包括GFP阳性肿瘤细胞均发生明显的凋亡。3.CIK细胞释放细胞因子ELISA检测通过ELISA检测,我们发现CIK与肿瘤细胞共培养释放大量的IFN-y,其释放浓度分别达到295.3±22.7Pg/ml与88.4±4.2Pg/ml,其他细胞因子包括IL-2、 TNF-αIL-4、IL-6、IL-10等虽有释放,然而其释放浓度较低。结论1.外周血单个核细胞经过多种细胞因子诱导后可培养成为成熟的CIK细胞,且主要效应细胞CD3/CD56双阳性细胞比例在培养2-3周后达到高峰；同时,随着培养时间延长,CIK细胞表面NKG2D分子比例增加。2.体外实验表明,培养成熟的CIK细胞对普通肿瘤细胞具有较明显的杀伤作用,且杀伤效应与CIK细胞呈剂量梯度关系,作用比例越大,其抑瘤效果更明显。3.CIK细胞处理后,HCC迁移侵袭能力下降,同时两个HCC细胞株成球能力均有不同程度下降。而肿瘤成球能力是反映肿瘤中干细胞含量多少的一个重要指标,且通过直观观察肿瘤球与CIK细胞之间的相互作用也可以发现,CIK可以趋向并攻击肿瘤球。间接反映出,CIK细胞有可能对肝癌干细胞也有一定的杀伤作用。4.利用GFP标记Nanog表达后分选得到的GFP阳性细胞具有较强的干性特征,包括干性基因上调、成球能力、迁移侵袭能力增强等；5.体外实验证实,CIK细胞对这部分以GFP阳性为代表的肿瘤干细胞同样具有较强的杀伤效应。6. NOD/SCID小鼠体内实验证实,CIK细胞不仅能抑制肿瘤增殖,且对干细胞也具有杀伤效用。7.目前,CIK细胞抗瘤作用的机制尚未十分明确。我们通过体外实验证实,CIK细胞可通过表面NKG2D分子与肿瘤细胞表面相应配体结合后杀伤靶细胞。而这也可能是CIK细胞杀伤肿瘤干细胞的一个重要机制。同时,CIK细胞还能诱导肿瘤细胞发生凋亡,包括GFP阳性具有干性特征的肿瘤干细胞。CIK细胞与肿瘤细胞共培养后能分泌大量的IFN-γ从而起到抑瘤效果。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

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