Imp2在神经胶质瘤中作用及机制研究

发布时间：2018-06-06 18:49

  本文选题：Imp2 + 胶质瘤　； 参考：《吉林大学》2016年博士论文

【摘要】：本实验以人胶质瘤组织标本、胶质瘤细胞系为研究对象,研究Imp2在胶质瘤细胞中的表达,以及其对胶质瘤生物学功能的影响和潜在分子机制。本实验共分2部分:1.Imp2在人GBM中的表达及其对细胞生长的影响。胰岛素样生长因子2结合蛋白-2(Insulin-like growth factor 2 m RNA-binding protein 2,IGF2BP2,Imp2)是人脑发育过程中起重要作用的蛋白,研究发现其在多种恶性肿瘤中表达明显增高。近期研究发现Imp2作为致癌基因在胶质瘤的发生发展过程中起着重要作用,DNA微阵列和组织芯片技术亦已证实,Imp2在胶质瘤中的表达水平与其恶性程度呈正相关[3]。为了研究Imp2在GBM和正常脑组织中的表达差异,我们比较了49例临床GBM胶质瘤组织标本,和6例正常脑组织。结果在49例GBM临床标本中,43例脑胶质瘤标本中Imp2 m RNA(median log2 ratio=1.424),而正常脑组织标本中Imp2 m RNA(median log2 ratio=-0.13),表明GMB组织标本中Imp2 m RNA的表达水平升高。免疫组织化学染色结果显示,49例GBM组织标本中32例高表达Imp2,占65.3%,表明在GBM中,Imp2的蛋白表达也显著上调。利用NCBI数据库中已有的30例GBM组织标本与4例正常脑组织,进行比较计算Imp2表达的差异,算得GBM组织中,Imp2的表达明显升高(P=0.001)。通过前面的实验我们发现并证实了在GBM组织中Imp2存在异常表达,为了进一步探讨Imp2对GBM细胞增殖侵袭等特征的影响,我们建立了人胶质瘤细胞系U87和U251的Imp2稳定过表达和沉默细胞模型。Western blot结果表明我们成功的建立了Imp2过表达和敲除细胞模型。细胞增殖实验结果显示,与转入Vector的U87及U251细胞相比,转入Imp2过表达质粒的细胞有更强的增殖能力,相反,沉默Imp2会导致细胞增殖能力减弱。细胞划痕实验结果提示:用U87和U251细胞转染Imp2,或者转染Vector,我们发现Imp2过表达组细胞迁移速度明显大于Vector组(P0.05);Imp2基因沉默组细胞的迁移速度明显小于对照Scramble组(P0.05),表明Imp2表达量的高低直接影响了胶质瘤细胞的迁移能力。transwell实验结果发现:过表达Imp2可以明显增加胶质瘤细胞的侵袭能力(P0.01),而沉默Imp2导致神经胶质瘤细胞的侵袭性减弱(P0.05)。这些结果说明,Imp2过表达可以增加U87和U251GBM细胞的增殖、迁移和侵袭能力;沉默Imp2细胞可以显著降低细胞的增殖、迁移和侵袭能力。综上所述,我们验证了在人的GBM胶质瘤组织标本中,Imp2 m RNA及蛋白高表达。在Imp2异常表达的人胶质瘤细胞系中,Imp2对细胞的增殖、迁移及侵袭能力都有影响,我们进一步用实验探讨其可能机制。2.Imp2通过IGF2/PI3K/Akt信号通路调节细胞生长、上皮间质转化和耐药为了进一步探讨Imp2参与调控GBM增殖、迁移及侵袭的分子机制及可能涉及的信号转导通路,以及Imp2在GBM上皮间质转化和耐药中的作用。我们首先检测了在Imp2过表达和沉默模型中其下游靶蛋白IGF2的表达情况。结果发现,过表达或者沉默Imp2的细胞中IGF2 m RNA的表达无明显变化,而IGF2蛋白表达水平在Imp2过表达细胞中升高而在Imp2沉默细胞中降低,说明Imp2主要在转录后水平调节IGF2的表达,导致IGF2 m RNA翻译增加,使细胞产生并分泌出更多的IGF2,进而与靶细胞表面的IGF1R受体结合,发挥调节作用。其次,有研究证实在其他细胞中,IGF2与IGF1R受体结合之后导致PI3K/Akt信号通路激活,促进细胞增殖等作用。因此本研究也检测了GBM细胞中P-Akt和Akt蛋白的表达情况。结果发现:U87和U251细胞中,过表达Imp2导致细胞内p-Akt表达水平上升,而沉默Imp2导致p-Akt表达水平下降;Akt蛋白的表达不受Imp2的影响。这提示在胶质瘤中,Imp2可能也是通过激活依赖Akt磷酸化的信号通路调节细胞增殖。第三,为了验证Imp2是否通过PI3K-AKT信号通路调节胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭,我们选用通路中关键蛋白的抑制剂,IGF2的中和抗体IGF2 Ab和PI3K抑制剂LY294002,抑制IGF2或者PI3K蛋白,阻断这个信号通路,再来观察Imp2对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响。在U87和U251 Imp2过表达和对照组细胞中,加入IGF2 Ab和LY294002抑制IGF2或者PI3K蛋白之后,二者能部分或者全部抵消了Imp2过表达所带来的增强胶质瘤细胞增殖的效应。表明Imp2通过IGF2/PI3K/Akt信号通路调节胶质瘤细胞的增殖。在Vector对照组细胞中,加入IGF2中和抗体阻断IGF2,发现GBM细胞迁移和侵袭的能力显著降低(P0.05);在Imp2过表达细胞中,加入同浓度的IGF2中和抗体,与加入PBS的对照组相比,细胞的迁移和侵袭能力都显著下降(P0.05)。加入PI3K阻断剂LY294002,行细胞划痕和Transwell实验,发现无论在Vector转染细胞中,还是在Imp2质粒转染细胞中,与加入DMSO的对照组相比,细胞的迁移和侵袭能力都显著下降。这些结果表明Imp2通过IGF2/PI3K/Akt通路调节了GBM细胞的增殖、迁移和侵袭作用。第四,众所周知,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤发展和恶化中的重要机制,并且PI3K/Akt通路在这个过程中发挥了核心作用。因此我们推测Imp2可能通过PI3K/Akt通路参与GBM的EMT。RT-PCR和western blot结果显示Imp2过表达可以在m RNA和蛋白水平导致E-cadherin下降和Vimentin、N-cadherin表达升高,而沉默Imp2可以升高E-cadherin表达并且减低Vimentin和N-cadherin的表达。提示上皮间质转化也许在Imp2调节细胞的增殖、迁移和侵袭能力的重要机制。最后,耐药实验发现,与沉默Imp2的U87耐药细胞和普通U87耐药细胞相比,Imp2过表达的细胞在不同的TMZ浓度下其增殖能力均强于相应的对照组细胞,抑制Imp2表达可导致GBM细胞的增殖能力减弱。细胞形成克隆实验表明:Imp2过表达和沉默的U87耐药细胞在未加入TMZ情况下,细胞形成克隆数目在组间无差异。在50μM和100μM的TMZ浓度下,过表达Imp2的U87-RE细胞与U87-RE细胞相比,细胞克隆形成数目都显著提高(P0.05)。而沉默Imp2的U87-RE细胞与对照U87-RE细胞相比,细胞克隆形成数目显著降低(P0.05)。这些结果表明Imp2参与了GBM细胞对替莫唑胺敏感性的调节。通过本研究我们证实了Imp2在GBM的异常表达不仅参与了细胞增殖、迁移和侵袭,也在其EMT和对替莫唑胺的耐药性中发挥了重要作用,这些作用可能是通过PI3K-AKT信号通路所介导。
[Abstract]:Insulin - like growth factor 2 ( IGF2BP2 , Imp2 ) plays an important role in human brain development . The results showed that Imp2 overexpression could increase the proliferation , migration and invasion ability of glioma cells . The results showed that Imp2 overexpression could increase the proliferation , migration and invasion ability of glioma cells . The effect of Imp2 on the proliferation , migration and invasion of glioma cells was investigated . The results showed that Imp2 overexpression and silencing of U87 - RE cells induced E - cadherin decreased and vimentin and N - cadherin increased significantly ( P0.05 ) .
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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本文编号：1987753