新型HOCl荧光探针发光检测及其对A549细胞生长影响的初步研究

发布时间：2018-06-07 05:00

本文选题：次氯酸 + 荧光探针　；参考：《山东大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景和研究目的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是一种有氧代谢的副产物,主要包括超氧负离子,过氧化氢和羟基自由基,它们在生物体内都具有不同的靶向物。ROS不仅能够通过损伤脂类,蛋白质和DNA诱导疾病的发生,同时也能够作为信号分子调节生理和病理过程。次氯酸(Hypochlorousacid,HOCl)是生物体内重要的活性氧之一,在体内主要由髓过氧化物酶和血管过氧化物酶1(Vascularperoxidase-1,VPO1)催化产生,能够与多种物质如蛋白质,脂类,核酸等发生化学修饰反应。HOCl在人类免疫功能系统中发挥重要功能,在炎症部位HOCl浓度会明显增加,有助于对入侵细菌和病原体进行破坏。但是,次氯酸或次氯酸盐浓度过高会导致组织损伤和一系列疾病,如动脉硬化、关节炎甚至诱发癌症等。因此设计合成具有专一性强、灵敏性高的新型HOCl荧光探针,建立应用于细胞内HOCl的荧光显微成像方法,以实现对细胞内次氯酸浓度变化的实时监测是非常必要的。然而,到目前为止,能够用于检测HOCl的比率型荧光探针仍然少之又少。所报道的大部分HOCl荧光探针都是单一发射光谱,输出的荧光信号很容易受到探针浓度,仪器敏感性等环境条件的干扰。因此设计合成一些新型有效的HOCl荧光探针具有重要的科学意义和应用前景。近年来,癌症的发病率和死亡率逐年增加,已经成为中国人口的主要死因和重大公共卫生问题。2015年,约400万新发癌症病例和300万癌症死亡病例发生在中国,其中肺癌是最为常见的癌症发生和最主要的癌症死亡原因。全球最新癌症统计数据也显示,在2012年,全球有约1.41千万新发癌症病例,820万患者死于癌症。其中57%的癌症病例以及65%的癌症死亡病例来自发展中国家。不论是发达还是发展中国家,肺癌是男性的首位癌症死因。肺炎是许多下呼吸道疾病以及肺癌早期所出现的一个关键特征,主要是由于肺吸入大量过敏原,环境污染物,微生物固定繁殖和吸烟所致。同时肺炎会引起吞噬细胞聚集,产生大量杀菌物质。其中产生的ROS和活性氮(RNS)发挥着关键作用。此外肺炎症部位也有MPO的存在。异常浓度的HOCl能够诱导细胞凋亡或直接引起细胞坏死。研究发现,HOCl或MPO/H2O2/Cl-系统可使体外肺细胞或体内肺组织中3-氯酪氨酸和脂过氧化产物等的水平升高。HOCl能够使A549细胞发生诱变。因此,要抑制或治疗称之为癌症之首的肺癌,亟需开发新型抗肺癌细胞增殖的药物,本课题组针对次氯酸新合成了一系列新型荧光次氯酸探针,并从化学遗传学的角度出发,找到能够明显抑制A549细胞生长的小分子,初步研究其抑制A549细胞生长的机制,可以为抗癌药物的研发提供新思路,为药物靶点寻找提供新线索。研究方法1)点扫描共聚焦显微镜检测HOCl探针细胞内的发光效果和光稳定性;2)倒置显微镜观察细胞形态;3)SRB法检测细胞存活率;4)LDH法检测细胞坏死;5)Hoechst33258染色检测细胞凋亡;6)吖啶橙(AO)染色法检测细胞核断裂;7)免疫印迹实验分析PARP切割水平;8)TUNEL染色法检测细胞凋亡;9)体视显微镜分析 CAN(7-Diethylamino-3-(2,3-dihydro-1H-perimidin-2-yl)-chromen-2-one,7-二乙氨基-3-(2,3-二氢-1H-perimidin-2-基)-苯并吡喃-2-酮)对鸡胚尿囊膜(Chick chorioallantoic membrane,CAM)中肿瘤细胞成瘤性和血管生成的影响;10)萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒检测Nrf2酶活性;11)MPO(Myeloperoxidase)试剂盒检测细胞内HOC1水平变化。实验结果1)CAN等新型HOCl荧光探针在细胞内具有良好的发光特性和光稳定性;2)CAN能够检测RAW264.7细胞中HOCl水平;3)CAN不与线粒体或溶酶体共定位;4)CAN不影响人脐静脉血管内皮细胞增殖;5)CAN体外诱导A549细胞凋亡;6)CAN通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤细胞生长;7)CAN促进Nrf2酶活性增加;8)CAN降低A549细胞内HOCl水平。实验结论利用RAW264.7细胞,我们验证了 CAN等一系列新型HOCl荧光探针在细胞中具有良好的发光效果和光稳定性,除CAN可以诱导RAW264.7细胞死亡不适宜在细胞中检测HOCl,其他探针都可以用于检测RAW264.7细胞中内源性的HOCl水平。此外,CAN能够显著抑制A549细胞生长并诱导细胞凋亡,但是对血管内皮细胞存活率没有影响,进一步我们以鸡胚尿囊膜为模型,利用TUNEL染色证明,在体内CAN可以通过细胞凋亡抑制肿瘤细胞生长,但是对正常的CAM血管生成没有作用。CAN能够降低细胞内HOCl水平,这说明CAN可以通过直接螯合HOCl降低A549细胞内HOCl水平,或者影响MPO酶活性以降低细胞内HOCl生成水平,诱导A549细胞凋亡;此外CAN也可能通过降低HOCl,影响Nrf2酶活性,进一步打破ROS平衡或影响HOCl理化修饰功能,最终诱导A549细胞凋亡。
[Abstract]:The research background and research purpose reactive oxygen species ( ROS ) is a by - product of aerobic metabolism , which mainly includes superoxide anion , hydrogen peroxide and hydroxyl radical , which can be used as signal molecule to regulate physiological and pathological process . A series of novel fluorescent hypochlorite probes were synthesized in the study group for hypochloral acid . From the perspective of chemical genetics , we found the mechanism of inhibiting the growth of A549 cells . We verified that a series of novel HOCl fluorescent probes , such as CAN , have good luminescence effect and photostability in cells . In addition , CAN can induce RAW264.7 cell death , it is not suitable to detect HOCl in RAW264.7 cells .
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R73-36

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