C-Raf激酶结合蛋白KAP1在肺癌发生中的机理研究

发布时间：2021-03-10 15:49

肺癌是所有癌症相关死亡的主要原因之一。事实上,单独的肺癌死亡超过了接下来三种最普遍的癌症死亡(结肠癌,乳腺癌和前列腺癌)的总和。肺癌的预后不良部分是由于在早期疾病进展期间缺乏任何明显症状的晚期诊断。此外,在NSCLC中鉴定的包括突变,扩增,缺失和融合在内的多种基因改变加重了信号通路和生理活性的异常。因此,探究治疗肺癌的有效靶点迫在眉睫。近几十年的研究表明有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径转导许多不同的信号,从而产生了广泛的细胞反应,包括细胞增殖,分化,存活,迁移,神经元功能和免疫应答。Raf激酶(Rapidly Accelerated Fibrosarcoma)是逆转录病毒致癌基因,它调控细胞的分化、转化、生长和凋亡等诸多生命过程,Raf-MEK-ERK通路是细胞信号传导的一条主干通路,这条通路的异常调控是细胞癌变的主要原因之一。RAF激酶的生理调节是复杂的,并涉及几个步骤,包括蛋白质与蛋白质之间的相互作用,磷酸化,去磷酸化和构象变化。且C-RAF作为MAPK通路中的主要枢纽蛋白,其功能及结合蛋白对肺癌的发生发展具有重要作用。KAP1是人源TRIM基因家族的成员,并且与其它三种TRIM蛋白(TIF1α,TIF1γ和TIF1δ)高度相关。KAP1是正常发育和分化的关键调节物;缺乏KAP1的小鼠在预处理前死亡,而在成年前脑中特异性缺失KAP1的小鼠表现出更高水平的焦虑和应激诱导的学习及记忆的改变。KAP1还参与维持多能性,是小鼠胚胎干细胞的终末分化所必需的,并且已经与促进和抑制不同成人细胞类型的分化相关。KAP1在正常和肿瘤细胞的增殖和分化中起关键作用。本研究发现C-RAF可以特意结合KAP1;实验检测了临床肺癌组织及邻近正常肺组织中KAP1的表达水平,实验发现KAP1在肺癌组织中高表达。在细胞实验中,利用CRISP/cas9技术成功的在肺癌A549细胞株中成功敲除KAP1,并进行了 rescue实验。实验发现敲除KAP1后,细胞增殖率显著降低;在化疗药物敏感中发现敲除KAP1后A549细胞对顺铂及5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性显著增加,且发现低浓度的5-FU基本不会促进A549细胞的凋亡,敲除KAP1后细胞明显发生凋亡;通过western blot实验检测野生A549细胞、rescue细胞及敲除KAP1细胞确定了敲除KAP1后,ERK会被异常激活;划痕及transwell实验发现敲除KAP1后细胞迁移受到显著抑制;成球实验发现敲除KAP1成球率显著降低,且western blot显示细胞干性标志物明显降低;软琼脂克隆形成发现敲除KAP1后克隆形成数目及大小显著减少;血管形成发现敲降KAP1后,血管形成能力显著下降;EMT转化实验发现敲除KAP1后,细胞转化能力明显减弱;流失细胞术显示细胞周期受到显著抑制;移植瘤实验表明敲除KAP1后裸鼠移植瘤的体积及重量明显减小;裸鼠体重明显增加;AKO组移植瘤的增殖速度明显慢于A549组。移植瘤HE染色显示:A549组较AKO组相比,肿瘤细胞形态不规则,胞核肥大、呈蓝色深染、核分裂相多见,偶见腺腔样结构。本研究表明KAP1在肺癌细胞A549中具有重要作用,敲除后细胞增殖生长、细胞干性、侵袭迁移能力、血管形成能力及细胞周期受到抑制,且会异常磷酸化ERK,提高A549细胞对5-FU的敏感性。目前对于C-RAF及KAP1在肺癌发生发展的作用还很少,本研究对于它们在肺癌发病机制中的作用进行了初步探索,为临床治疗肺癌提供理论依据和新的作用靶点。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

文章目录

摘要

Abstract

缩略语索引

前言

1.1 肺癌

1.1.1 简介

1.2 肿瘤的治疗

1.2.1 简介

1.2.2 辅助治疗

1.2.3 化疗

1.2.4 放射治疗

1.2.5 分子靶向治疗

1.2.6 免疫疗法在NSCLC中的作用

1.3 Raf-MEK-ERK在肿瘤中的作用

1.3.1 Raf激酶

1.3.2 Raf激酶信号通路

1.3.3 Raf激酶结构

1.3.4 Raf激酶活性的调节

1.3.5 c-Raf调控

1.3.6 激酶活性需要Raf二聚体的形成

1.3.7 Raf激酶结合蛋白与肿瘤治疗

1.4 KAP1

1.4.1 简介

1.4.2 KAP1蛋白结构

1.4.3 KAP1的转录功能

1.4.4 KAP1的非转录功能

1.4.5 KAP1在细胞生理学中的意义

1.4.6 KAP1与肿瘤治疗

1.5 本论文的研究意义

第二章用免疫沉淀法（co-IP）和蛋白组学的方法系统识别c-Raf激酶的结合蛋白

2.1 实验材料和方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器设备

2.1.3 实验试剂配方

2.1.4 实验方法

2.2 实验结果

2.2.1 质谱结果

2.2.2 Western blot检测KAP1

2.3 小结与讨论

第三章构建pcDNA3.1-KAP1质粒及稳定细胞系的构建

3.1 实验材料及方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 实验结果

3.2.1 琼脂糖凝胶电泳验证细胞总RNA提取

3.2.2 琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物

3.2.3 琼脂糖凝胶电泳验证酶切产物

3.2.4 琼脂糖凝胶电泳验证胶回收产物

3.2.5 菌落PCR验证

3.2.6 测序结果比对

3.2.7 KAP1稳定细胞系验证

3.3 小结与讨论

第四章构建px459-KAP1敲除质粒及稳定细胞系

4.1 实验内容

4.1.1 实验原理

4.1.2 实验目的

4.1.3 实验流程

4.2 实验材料

4.2.1 实验试剂

4.2.2 实验细胞、菌株及质粒

4.3 Crisp Cas9基因敲除实验方案

4.3.1 质粒构建

4.3.2 敲除细胞系CruiserTM酶验证

4.4 实验结果

4.4.1 测序结果比对

4.4.2 western blot检测A549-px459-KAP1稳定细胞系

4.4.3 CruiserTM酶切结果表明敲除细胞构建正确

4.4.4 基因组水平验证A549-px459-KAP1敲除细胞

4.5 小节与讨论

第五章 KAP1蛋白在肺癌中的表达

5.1 实验内容

5.2 实验材料

5.2.1 实验用组织样品

5.2.2 实验器材及试剂

5.3 实验结果

5.3.1 KAP1在不同类型肺癌中的表达

5.3.2 western blot验证肺癌标本中KAP1的表达情况

5.4 小结

第六章 KAP1蛋白在肺癌A549中的作用

6.1 实验内容

6.2 实验材料

6.3 实验方法

细胞增殖实验

检测细胞的药物敏感性

划痕实验

Transwell小室实验

细胞成球实验

软琼脂克隆形成

血管形成

EMT实验

流式细胞术周期测定

裸鼠移植瘤

6.4 实验结果

6.4.1 CCK8检测细胞增殖

6.4.2 CCK8检测化疗药物敏感实验

6.4.3 划痕实验

6.4.4 transwell实验

6.4.5 成球实验

6.4.6 软琼脂克隆形成实验

6.4.7 血管形成实验

6.4.8 EMT实验

6.4.9 流式细胞术检测细胞周期实验

6.4.10 裸鼠移植瘤试验

6.5 小结

第七章总结与讨论

致谢

参考文献

附录A

【参考文献】