黏蛋白-1激活AKT和ERK对非小细胞肺癌生物学特性影响

发布时间：2018-06-13 16:43

本文选题：黏蛋白-1 + 血管内皮细胞生长因子　；参考：《郑州大学》2015年博士论文

【摘要】：目的黏蛋白-1(Mucin 1,MUC1)是一种跨膜的糖蛋白,MUC1蛋白在多种癌症组织中都异常高表达,其中包括非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。已知新生血管的形成在肿瘤的发生、生长、浸润和转移四个过程中都具有非常重要的意义,肿瘤组织中内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是主要的促进新生血管形成机制。本课题旨在研究MUC1和VEGF在NSCLC组织中表达的相关性,进一步研究过表达MUC1基因对NSCLC细胞生物学特征影响及其分子机制。方法定量PCR检测MUC1和VEGF m RNA在NSCLC癌组织和癌旁组织中的表达;免疫组化法检测MUC1和VEGF在100例NSCLC组织中的表达,分析二者的相关性。通过在A549和NCI-H460细胞中转染MUC1基因进而观察过表达MUC1对NSCLC促血管生成的影响。逆转录PCR和蛋白质印迹法用于检测转染细胞中MUC1 m RNA和蛋白表达的情况。收集转染细胞培养上清,并与人静脉内皮细胞孵育,应用内皮细胞迁移实验和血管形成实验研究过表达MUC1对于NSCLC细胞促内皮细胞迁移和形成血管样结构的能力的影响。通过MTT实验分析过表达MUC1对NSCLC细胞增殖的影响。应用克隆形成实验分析分析MUC1基因过表达后NSCLC细胞克隆形成能力的影响。MUC1基因过表达后应用细胞粘附实验检测NSCLC细胞粘附于纤维连接蛋白的能力;应用碘化丙啶染色法结合流式细胞术检测NSCLC细胞细胞周期分布情况。酶联免疫吸附实验(ELISA)研究转染细胞培养上清中的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。通过慢病毒载体系统建立稳定MUC1基因过表达的A549细胞,通过MTT实验和裸鼠荷瘤实验分析MUC1对细胞增殖的影响。采用蛋白质印迹法检测过表达MUC1基因对总的以及磷酸化的蛋白激酶B(PKB或AKT)、胞外信号调控激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路、p38以及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)表达的影响。同时,应用ERK和AKT抑制剂PD9859和SH-5预处理NSCLC细胞,观察抑制ERK或者AKT的活化对血管形成的影响。结果MUC1和VEGF m RNA在NSCLC癌组织中的表达明显高于癌旁组织。MUC1的表达与NSCLC肿瘤大小、组织学类型、分化程度、淋巴结转移和TNM分期都有统计学意义,但其阳性率与患者的年龄、性别、是否吸烟之间无统计学意义。VEGF的表达与NSCLC肿瘤大小、组织学类型、性别、淋巴结转移和都有统计学意义,但其阳性率与患者的年龄、分化程度、是否吸烟、TNM分期之间无统计学意义。MUC1与VEGF的表达呈显著正相关(r=0.380,p0.01)。RT-PCR结果显示,转染MUC1基因导致A549和NCI-H460细胞MUC1m RNA表达增强。蛋白质印迹法显示,在转染MUC1基因的A549和NCI-H460细胞中MUC1蛋白的表达量显著增加。同时,RT-PCR和酶联免疫吸附试验则显示,在A549和NCI-H460细胞中过表达MUC1能够显著增强VEGF的表达和分泌。在A549和NCI-H460细胞中过表达MUC1能够显著增强依赖于血管内皮细胞生长因子的内皮细胞的迁移和小管的形成,应用VEGF中和性抗体可显著逆转MUC1诱导的内皮细胞迁移和血管形成作用。过表达MUC1对A549和NCI-H460细胞周期分布以及粘附能力都没有显著影响。MUC1基因过表达能够明显促进细胞增殖和细胞克隆能力。动物实验结果显示MUC1基因过表达后能够显著促进A549细胞移植瘤的生长,瘤重和瘤体积都明显高于对照组。蛋白质印迹法检测在过表达MUC1基因的A549和NCI-H460细胞中总AKT、ERK、p38及JNK均没有明显的变化。但是,过表达MUC1基因能够显著增强AKT和ERK的磷酸化,但是对p38和JNK的磷酸化均没有明显的影响。应用ERK和AKT抑制剂PD9859和SH-5预处理NSCLC细胞可以显著逆转MUC1介导的促血管生成作用。结论MUC1和VEGF在NSCLC组织中的表达明显增高与NSCLC发生发展密切有关,且MUC1与VEGF的表达呈显著正相关。在NSCLC细胞中,过表达MUC1基因可以诱导VEGF的表达和分泌,进而明显增强依赖于VEGF的内皮细胞迁移和血管状结构的形成。过表达MUC1有利于肺癌细胞克隆形成和增殖。在NSCLC细胞中过表达MUC1基因能够显著提高AKT和ERK磷酸化和活性,进而增强NSCLC细胞促血管生成能力。
[Abstract]:Objective Mucin - 1 ( MUC1 ) is a transmembrane glycoprotein , and MUC1 protein is abnormally high in a variety of cancer tissues , including non - small cell lung cancer ( NSCLC ) . The effects of MUC1 and VEGF on the proliferation of NSCLC cells were investigated by MTT assay . p0.01). The expression of MUC1 gene in A549 and NCI - H460 cells was significantly higher than that of control group .
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

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