RARα和NLS-RARα蛋白的细胞生物学功能分析及其作为转录因子的实验研究

发布时间：2018-06-15 23:43

本文选题：NLS-RARα + RARα　；参考：《重庆医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：第一部分携带RARa基因的重组腺病毒表达质粒的构建及其对人白血病细胞的影响目的：用AdEasy系统构建人RARa基因重组腺病毒表达质粒,感染人白血病细胞株NB4后用一定浓度的全反式维甲酸ATRA诱导,观察其对白血病细胞株增殖、分化和凋亡的影响,同时与变异型NLS-RARa的细胞生物学功能相比较,观察二者的生物学功能差异。方法：以白血病细胞株NB4的cDNA为模板,PCR扩增RARa基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-T04-RARα。用限制性内切酶EcoR V和SalⅠ双酶切及测序鉴定,然后转化含有骨架质粒AdEasy-1的大肠杆菌BJ5183菌株的感受态,同源重组获得重组腺病毒质粒Ad-RARα。酶切验证后,限制性内切酶Pac Ⅰ酶线性化后转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-RARα,经3轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。流式细胞术测定病毒感染效率,Western blot法检测重组腺病毒感染的人NB4细胞中RARa蛋白,CCK-8法检测重组腺病毒感染对NB4细胞增殖的影响,Annexin V/PI双染法测定细胞周期,PI测定细胞凋亡,Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达。结果：重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-T04-RARa构建成功,病毒感染效率可达70%,与对照组的NB4细胞相比,重组腺病毒感染的NB4细胞内RARa蛋白的表达明显升高(P0.05),且经一定浓度全反式维甲酸ATRA处理后,能够有效地促进感染重组腺病毒细胞的分化成熟和凋亡,变异蛋白NLS-RARa与之相比,NLS-RARa亦能促进白血病细胞增殖,抑制分化。结论：变异蛋白NLS-RARa与野生型RARa在白血病细胞株中过表达后均能促进细胞增殖,抑制细胞分化,在经一定浓度的维甲酸诱导后均能促进细胞分化成熟和凋亡,故得出结论：变异蛋白NLS-RARa与野生型RARa的细胞生物学功能相似,NLS-RARa可能通过与野生型RARa类似的功能影响白血病细胞株的细胞生物学功能。第二部分RARa和NLS-RARa的结合位点及转录调控的研究目的：通过研究NLS-RARa的结合位点,与RARa的结合位点相比较,证明NLS-RARa为一个变异的转录因子,可能与RARa竞争性结合某些基因而参与到APL的发生中。方法：构建维甲酸受体α (RARa)、视黄醛受体α (RXRa)及变异蛋白NLS-RARa的真核表达质粒,通过间接免疫荧光(IFF)观察RARα、RXRa和NLS-RARa的核浆分布,然后用免疫共沉淀(Co-IP)分别检测RARα、NLS-RARa同RXRa是否有相互作用；凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测RARα、NLS-RARa结合维甲酸反应元件DNA探针的能力；最后用荧光素酶报告实验检测RARa和NLS-RARa调控维甲酸反应元件活性的程度。结果：维甲酸受体α (RARa)、视黄醛受体α (RXRa)的真核表达质粒构建成功；间接免疫荧光结果显示,与RARa相比,NLS-RARa更多地分布在细胞核内；免疫共沉淀和Native-PAGE结果显示NLS-RARa与RXRa有相互作用,并能够形成二聚体；凝胶电泳迁移率实验和荧光素酶报告实验证明NLS-RARa能够结合维甲酸反应元件DNA探针及调控其转录活性。结论：该研究成功地构建了RARα、RXRa的真核表达质粒,并证明NLS-RARa有转录活性,NLS-RARa可能作为一个变异的转录因子参与影响白血病细胞株的增殖、分化等生物学功能,为丰富APL发生机制信号网络的研究奠定了一定的基础。
[Abstract]:The recombinant adenovirus expression plasmid pAdTrace - T04 - RARa was cloned into shuttle plasmid pAdTrace - TO4 . The recombinant adenovirus Ad - RARa was cloned into shuttle plasmid pAdTrace - TO4 . Methods : The eukaryotic expression plasmids of retinoic acid receptor 伪 ( RARa ) , retinoic acid receptor 伪 ( RXRa ) and variant protein - RARa were constructed by indirect immunofluorescence ( IFF ) .
gel electrophoresis mobility assay ( EMSA ) was used to detect the ability of RAR伪 , ~ RARa to bind to the DNA probe of the retinoic acid reaction element ;
The results showed that the eukaryotic expression plasmid of retinoic acid receptor 伪 ( RARa ) and retinoic acid receptor 伪 ( RXRa ) was successfully constructed .
Indirect immunofluorescence results showed that , in contrast to RARa , there was a greater distribution in the nucleus than RARa .
The results of immuno - co - precipitation and Native - PAGE showed the interaction with RXRa and the formation of dimers .
Conclusion : The study successfully constructed the eukaryotic expression plasmid of RAR伪and RXRa , and proved that the transcription activity and the transcription activity of the nuclear fusion protein were confirmed by this study .
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7

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