MiRNA-148b和miRNA-152在肾细胞癌中的表达及其功能与机制研究
发布时间：2018-06-16 05:47
本文选题：miRNA-148b + miRNA-152 ； 参考：《青岛大学》2016年博士论文
【摘要】：目的:研究miRNA-148b和miRNA-152在肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)中的表达情况及其功能,并进一步讨论其可能机制,以期为肾细胞癌的早期诊断和治疗提供新的思路。方法:本研究应用实时定量逆转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT PCR)检测在40例肾细胞癌及癌旁正常肾组织中miRNA-148b和miRNA-152的表达情况,研究其与临床分期、病理分级之间的关系。同时,应用合成的miRNA-148b和miRNA-152模拟物转染786-O及SN12-PM6细胞株,采用MTT比色法、凋亡检测、克隆形成检测、迁移侵袭检测,观察miRNA-148b和miRNA-152过表达对肾癌细胞功能的影响,研究其对肾癌细胞的增殖、凋亡、集落形成能力和侵袭迁移能力等生物学性状的影响。继之用生物信息学方法预测miRNA-148b和miRNA-152可能的靶基因,并用Western blot法检测miRNA-148b和miRNA-152转染的786-O及SN12-PM6肾癌细胞中KIT、AKT、m TOR、Bcl-2、Bcl-2L11等蛋白的表达情况。结果:实时定量PCR结果发现,与配对的癌旁正常肾组织相比,肾细胞癌组织中的miRNA-148b和miRNA-152的表达均下降,均有显著统计学差异(P0.01)。对不同的病理分级,高分化组(Fuhrman分级Ⅰ、Ⅱ级)的miRNA-148b和miRNA-152的相对表达含量分别与中低分化组(Fuhrman分级Ⅲ、Ⅳ级)的相对表达含量相比,均没有显著统计学差异(P0.05)。在不同的临床分期肾癌组织样本中,I期肾细胞癌组织中miRNA-148b和miRNA-152的相对含量与II~III期肾细胞癌组织中各相对自的含量相比,也均未见显著统计学差异(P0.05)。与对照组相比,在786-O和SN12-PM6细胞株,显示miR-148b和miR-152的过表达抑制细胞增殖效果明显,差异具有统计学意义(P0.05)。在786-O细胞株,转染48h和72 h后,miR-152和miR-148b对细胞凋亡有明显诱导作用,差异有统计学意义(P0.05)。在SN12-PM6细胞株,miR-152和miR-148b+miR-152在转染48 h和72 h后诱导了细胞凋亡,miR-152在转染后72 h对细胞凋亡有显著诱导作用(P0.05)。集落形成能力结果显示:在786-O和SN12-PM6细胞株肾癌细胞,转染miR-148b组细胞集落形成个数均明显低于对照组,两者具有显著性差异(P0.05);转染miR-152组细胞集落形成个数也明显低于对照组,两者具有显著差异(P0.05)。Transwell小室侵袭实验显示,两个细胞株中转染miR-148b组和miR-152组穿过膜侵袭的细胞数均明显低于阴性对照组,有显著统计学差异(P均0.01)。Transwell小室迁移实验表明,转染miR-148b组和miR-152组细胞穿过膜迁移的细胞数也均明显低于阴性对照组,有显著统计学差异(P均0.01)生物信息搜索显示KIT 3‘UTR第1650-1656位碱基与miR-148b和miR-152的种子序列互补。因此,我们推测KIT可能是miR-148b和miR-152的靶基因之一。Western blot结果证实,在786-O细胞株,转染24 h后miR-148b和miR-152能够降低p-KIT和KIT的整体表达。在所有观察的时间点,miR-148b和miR-152对p-AKT和AKT蛋白表达水平均有下调作用,而对下游信号通路的p-m TOR以及总m TOR的表达几乎没有影响。在所有时间点miR-148b和miR-152均可下调Bcl-2表达,但是对bcl-2L11蛋白表达无显著作用。在SN12-PM6细胞株,在所有观察的时间点,miR-148b和miR-152均可降低p-KIT的表达水平。在miR-148b和miR-152转染24h后对KIT蛋白的表达无明显影响,转染48h和72h后则明显降低了KIT的表达水平。miR-148b和miR-152转染后24 h下调了AKT和p-AKT的表达水平,而miR-152对AKT表达的下调作用更为显著。miR-148b和miR-152对p-m TOR以及总m TOR的表达几乎没有影响。在miR-148b和miR-152转染48和72 h后Bcl-2的表达减少,而对bcl-2L11蛋白表达无显著作用。结论:1.miR-148b和miR-152在人肾细胞癌组织中的表达水平较癌旁正常肾组织明显降低,但与肾细胞癌的病理分级及临床分期可能无明显相关性。2.miR-148b和miR-152对786-O和SN12-PM6肾癌细胞有抑制增殖和促进凋亡作用,并能抑制786-O和SN12-PM6肾癌细胞的集落形成能力和侵袭迁移能力。3.KIT为miR-148b和miR-152在肾细胞癌中的靶基因之一,miR-148b和miR-152可能是通过对KIT、AKT和Bcl-2表达的调控抑制肾细胞癌的发生发展。
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本文编号：2025600
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