LncRNA组合预测CRC预后和GAPLINC影响GC发生发展的机制

发布时间：2018-06-19 02:57

  本文选题：大肠癌 + lncRNAs　； 参考：《上海交通大学》2015年博士论文

【摘要】：第一部分lnc RNA组合与大肠癌病人预后的相关研究目的:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中具有预测价值的编码蛋白基因(protein coding gene,PCG)报道很多,却仅有很少能实际运用于临床,因此寻找有实用价值的分子标志物显得尤为迫切。越来越多的证据显示长链非编码(long non coding,lnc)RNAs在癌症中表达异常,然而目前lnc RNAs用于预测大肠癌病人的预后尚无报道,对lnc RNAs的研究也许能为CRC分子靶标的寻找带来一些启示。本课题拟筛选并建立一个lnc RNA组合,旨在探讨其对大肠癌病人预后的预测价值。方法:从GEO数据库下载CRC基因表达谱资料:GSE39582检测集(N=436),GSE39582内部验证集(N=117);GSE14333(N=197)和GSE17536(N=145),通过重新注释探针获取lnc RNA表达数据。在GSE39582检测集数据中,通过BRB tool array和多因素Cox回归方法筛选出一个lnc RNAs组合,基于这个lnc RNAs组合建立危险评分公式,并以危险分数中位数为分割将GSE39582检测集病人分成高风险组和低风险组,验证其预测GSE39582检测集中病人的无病生存期(disease free survival,DFS)的准确性。在GSE39582内部验证集和2个独立的CRC数据中进一步检验该lnc RNAs组合对CRC病人预后的预测能力。基因富集分析(Gene score enrichment analysis,GSEA)lnc RNAs组合与癌症的哪些通路相关。在CRC细胞系HCT116和SW1116中分别转染3条lnc RNAs,AK123657、BX648207和BX649059 si RNAs,CCK8和Transwell实验检测3条lnc RNAs分别敲低后对CRC细胞功能的影响。结果:我们筛选出一个六条lnc RNAs组合,建立风险公式:Risk score=(0.07826*AK024680)+(-0.14300*AK123567)+(-0.19355*CR622106)+(-0.00172*BX649059)+(-0.20855*BX648207)+(0.24326*AK026784)。Ln RNAs组合与GSE39582检测集CRC病人DFS相关。基于Risk score(RS)中位数,GSE39582检测集病人可以分为高风险组和低风险组(HR=2.670;P0.0001)。该lnc RNAs组合对CRC病人预后的预测能力在GSE39582内部验证集(N=117)和2个独立的CRC数据(GSE14333,N=197和GSE17536,N=145))中得到验证。GSEA分析结果提示lnc RNAs组合与多种癌症的转移通路相关。体外功能实验表明其中三条lnc RNAs,AK123657、BX648207和BX649059与CRC细胞侵袭和增殖抑制有关。结论:Lnc RNAs可能成为CRC临床预后一项有效的预测工具。第二部分Lnc RNA-GAPLINC促进GC发生发展的作用及其机制研究目的:越来越多的证据显示lnc RNAs与PCGs一样具备促癌或抑癌功能,lnc RNAs很可能成为一类新的癌症标志物和治疗靶标。本研究拟通过高通量芯片(microarray)筛选胃癌中异常表达的lnc RNAs,并且探讨其作为胃癌标志物对胃癌病人临床特征及生存期的预测能力,以及深入探讨其可能影响胃癌发生发展的功能与调控机制。方法:利用lnc RNA Arraystar基因芯片检测10对胃癌和对应癌旁正常组织中lnc RNAs和m RNAs的表达情况。探讨异常表达的lnc RNAs是否与基因组拷贝数变异(copy number variation,CNV)和转录因子激活有关,并通过实时定量(real-time quantative,RT-q)PCR和染色质免疫共沉淀实验(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)验证预测结果。我们利用“缩小重心法”分别建立一个lnc RNAs和m RNAs表达公式用于区分胃癌或正常胃黏膜组织,并对比lnc RNs和m RNAs组合区分癌症和正常组织的准确性。选取最有预测价值的lnc RNA,在90例胃癌病人的癌组织和癌旁正常组织标本采用原位杂交技术(in situ hybridyzation,ISH)检测该lnc RNA的表达情况,并分析其与各临床特征之间的相关性。将胃癌细胞系MGC803转染lnc RNA si RNAs和对照si RNAs后,采用表达谱芯片Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 microarrays(三次重复;GEO#GSE51651)筛选lnc RNA下游通路和靶基因。通过si RNAs干扰和转染质粒的方式检测敲低和升高lnc RNA后对胃癌MGC803和SGC7901细胞凋亡、增殖、侵袭等功能的影响,以及对“细胞迁移通路”中主要蛋白CD44的RNA和蛋白水平的影响。通过多步实验结果初步设想lnc RNA结合micro RNA(mi RNA)发挥其对下游基因的调控。采用生物信息学方法预测mi RNA与lnc RNA和CD44发生相互作用的位点,构建lnc RNA和CD44 3’UTR的荧光素酶报告基因,明确mi RNA结合lnc RNA和CD44的结构域。观察lnc RNA对裸鼠皮下移植瘤生长的影响,实验组注射稳定敲低lnc RNA的MGC803细胞系,对照组注射稳定表达空白载体的MGC803细胞系,并分离瘤体检测lnc RNA、mi RNA及CD44在两组中的表达差异。结果:Lnc RNAs在胃癌中的异常表达与拷CNV和转录激活有关。P53突变体R282W对lnc RNA-uc002kmd.存在转录激活作用。Lnc RNAs用于区分胃癌和正常黏膜组织的能力与m RNAs的相当(两者最低错误率都为0.196)。建立的lnc RNAs预测组合包括九条lnc RNAs,差异表达最大的是uc002kmd.1,其在胃癌组织中的表达水平明显高于相应的癌旁正常胃黏膜组织。48对胃癌和癌旁正常组织中运用RT-q PCR技术检测uc002kmd.1的表达量,胃癌组织中其表达量显著增高。ROC曲线评价uc002kmd.1预测胃癌组织的敏感性和特异性很高,曲线下面积(area under curve,AUC)为0.714。考虑到uc002kmd.1预测胃癌的能力,我们将其命名为GAPLINC(Gastric Adenocarcinoma Predictive Long Intergenic Non-Coding RNA)。GAPLINC的表达水平与胃癌病人肿瘤体积、远处转移、肿瘤累及3/5淋巴结组比率以及临床分级等因素呈明显正相关(P0.01)。GAPLINC高表达可显著降低胃癌细胞凋亡、促进增殖和侵袭能力。通过表达谱芯片筛选和GSEA分析,GAPLINC下游基因中相当一部分与“细胞转移通路”密切相关,GAPLINC的表达水平与CD44具有强相关性;GAPLINC发挥原癌基因功能部分依赖于CD44;裸鼠试验中体内敲低GAPLINC可明显抑制移植瘤生长,GALINC稳定敲低组标本中GAPLINC及CD44水平均低于对照组;荧光素酶报告实验提示GAPLINC通过与CD44竞争结合mi R-211-3p,从而影响CD44的表达水平。结论:本研究提示CNV和转录活化影响胃癌中lnc RNAs的表达。GAPLINC可作为影响胃癌发生发展的重要因子,在体内组织学水平和体外细胞学水平调控胃癌增殖、侵袭、转移等情况,从而影响胃癌患者的预后,且其功能的发挥部分依赖于CD44;GAPLINC通过与CD44竞争结合mi R-211-3p发挥对CD44的调控作用。
[Abstract]:In GSE39582 , we screened and established an lnc RNA composition for predicting the prognosis of patients with colorectal cancer . Risk score = ( 0.07826 * AKE24680 ) + ( - 0.14300 * AK123567 ) + ( - 0.19355 * CR22106 ) + ( - 0.19355 * CR22106 ) + ( - 0.20855 * B29649059 ) + ( - 0.20855 * ) . Ln RNAs combination was related to the GSE39582 detection set CRC patient DFS . Based on the median of Risk score ( RS ) , GSE39582 test set patients could be classified into high - risk groups and low - risk groups ( HR = 2.670 ; P0.0001 ) . In this study , the expression of lnc RNAs and mRNA in normal tissues of gastric cancer and normal tissues of gastric cancer were studied by means of high throughput chip ( RT - q ) PCR and chromatin immunocodeposition ( Ch IP ) . The expression level of lnc RNA and CD44 in gastric cancer was significantly higher than that of normal gastric mucosa . The expression level of lnc RNA and CD44 in gastric cancer was significantly higher than that of normal gastric mucosa . GAPLINC plays an important role in the development of gastric cancer . GAPLINC plays an important role in inhibiting the proliferation , invasion and metastasis of gastric cancer . GAPLINC plays an important role in inhibiting the growth of gastric cancer . GAPLINC plays an important role in inhibiting the growth of gastric cancer . GAPLINC plays an important role in the prognosis of gastric cancer patients .
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34

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本文编号：2038078