TIGAR在肝癌细胞对表阿霉素化疗耐受中的作用及相关机制研究

发布时间：2018-06-19 21:59

本文选题：TIGAR + 凋亡　；参考：《苏州大学》2015年博士论文

【摘要】：目的:观察化疗药表阿霉素对肝癌细胞p53诱导的糖酵解和凋亡调节子(TIGAR)蛋白表达的影响以及TIGAR在肝癌细胞对表阿霉素化疗耐受中的作用;探讨TIGAR影响肝癌细胞对表阿霉素耐药的初步机制。方法:Western blot法检测表阿霉素对肝癌细胞TIGAR蛋白表达的影响;采用小干扰RNA技术干扰肝癌细胞TIGAR表达后通过MTT及克隆形成实验分别检测干扰TIGAR表达联合表阿霉素治疗对肝癌细胞生存的短期和长期影响;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测干扰TIGAR表达联合表阿霉素治疗对肝癌细胞凋亡的影响;采用慢病毒构建的TIGAR-sh RNA感染Hep G2肝癌细胞,经嘌呤霉素筛选,western blot及细胞免疫荧光法检测干扰效率,得到稳转株后通过裸鼠成瘤实验检测干扰TIGAR表达对肝癌肿瘤形成、生长及其对表阿霉素化疗疗效的影响;2’,7’-二氯二氢荧光素双醋酸盐(DCFH2-DA)标记流式细胞术、GSH检测试剂盒及NADPH检测试剂盒分别检测细胞内活性氧(ROS)水平、GSH/GSSG比值及NADPH水平;Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白水平;细胞免疫荧光法、western blot及电镜技术检测干扰TIGAR表达对肝癌细胞自噬的影响;彗星实验检测细胞DNA损伤情况;采用细胞核质分离技术分离细胞核后western blot分别检测胞浆及胞核中TIGAR的表达;运用细胞免疫荧光及western blot技术检测DNA损伤修复中相关蛋白ATM、Cdk5等的表达。结果:为了研究表阿霉素对肝癌细胞TIGAR表达的影响,我们采用不同浓度的表阿霉素作用肝癌Hep G2细胞不同时间后,western blot检测TIGAR表达,结果显示,低浓度短时间的表阿霉素作用可诱导Hep G2肝癌细胞TIGAR表达,高浓度长时间的表阿霉素作用后TIGAR表达下调。且表阿霉素诱导的TIGAR表达是依赖p53变化的。为了进一步探讨表阿霉素诱导的肝癌细胞TIGAR高表达在肝癌细胞对表阿霉素疗效中的作用,我们采用小干扰RNA干扰肝癌Hep G2细胞TIGAR表达后通过MTT、克隆形成实验及流式等体外实验检测发现,干扰TIGAR表达联合表阿霉素作用后肝癌Hep G2细胞的存活明显下降,细胞凋亡显著增加;此外,通过体内实验即裸鼠成瘤实验检测干扰TIGAR表达对肝癌细胞成瘤的影响以及移植瘤对表阿霉素疗效的影响,结果显示,干扰TIGAR表达抑制肝癌的形成和生长,同时也增加了其对表阿霉素的化疗敏感性。研究还发现,不仅对于肝癌细胞,表阿霉素也增加了肺癌A549细胞的TIGAR表达且干扰TIGAR表达增加肺癌A549细胞对表阿霉素的化疗敏感性。肿瘤的化疗耐受与多种机制相关,其中ROS适应性反应、细胞自噬及细胞DNA损伤修复在肿瘤化疗耐药的形成中起着重要作用,TIGAR作为p53下游基因,通过抑制细胞糖酵解及增加磷酸戊糖通路产生NADPH降低细胞内ROS水平,从而降低ROS引起的细胞凋亡、ROS介导的细胞自噬激活及ROS诱导的DNA损伤修复,此外,磷酸戊糖通路的激活增加了DNA合成原料核苷酸的生成,有利于受损DNA的修复。因此,为了进一步探讨干扰TIGAR表达在肝癌细胞对表阿霉素化疗增敏中的机制,我们从细胞凋亡、细胞自噬及细胞DNA损伤修复三方面来进行研究。第一,干扰TIGAR表达显著增加表阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡,并与ROS水平增加、Caspase3激活相关。采用NADPH或NAC清除细胞ROS水平或采用Z-VAD-FMK抑制Caspase3后可部分减轻细胞凋亡。提示,干扰TIGAR表达增加肝癌细胞对表阿霉素化疗敏感性与干扰TIGAR表达增加细胞凋亡有关。第二,干扰TIGAR表达显著增加表阿霉素诱导的肝癌细胞自噬激活,表现为LC3I向LC3 II转化增加、自噬体增多及自噬底物p62蛋白水平的下调。干扰TIGAR表达增加表阿霉素诱导的肝癌细胞自噬激活通过增加细胞ROS水平及抑制m TOR通路来实现,NADPH清除ROS后可部分抑制干扰TIGAR表达联合表阿霉素作用激活的自噬。采用3-MA或干扰Atg5抑制细胞自噬后进一步增加了干扰TIGAR表达联合表阿霉素作用所致的肝癌细胞凋亡。提示,干扰TIGAR表达增加表阿霉素诱导的肝癌细胞自噬激活对细胞的生存起保护作用,能够抵抗表阿霉素的毒性作用,在此基础上抑制细胞自噬能得到额外的抗肿瘤效果。即干扰TIGAR诱导的细胞自噬激活降低肝癌细胞对表阿霉素的化疗敏感性。第三,TIGAR增加磷酸戊糖通路产生NADPH减少细胞ROS从而减少DNA损伤,此外,产生的戊糖作为DNA合成原料有利于受损DNA的修复。表阿霉素除了诱导肝癌细胞TIGAR表达外还促进其入核,调控肿瘤细胞DNA损伤修复。干扰TIGAR表达显著增加表阿霉素诱导的肝癌细胞DNA损伤,当给予磷酸戊糖途径产生的戊糖、NADPH或ROS清除剂NAC后可部分缓解DNA损伤。提示干扰TIGAR表达除了通过抑制磷酸戊糖通路增加表阿霉素诱导的肝癌细胞DNA损伤外,还有其他机制的存在。进一步实验研究显示,TIGAR通过调节Cdk5来磷酸化DNA损伤修复关键蛋白ATM进而调控细胞DNA损伤修复。综上,TIGAR通过磷酸戊糖途径及Cdk5-AMT信号通路来调控表阿霉素对肝癌细胞DNA的损伤与修复进而影响肝癌细胞对表阿霉素的化疗敏感性。结论:表阿霉素诱导肝癌细胞TIGAR表达;干扰TIGAR表达增加肝癌细胞对表阿霉素的化疗敏感性,其机制涉及细胞凋亡增加、自噬水平激活以及细胞DNA的损伤与修复。TIGAR表达在肝癌细胞对表阿霉素耐受中的作用提示TIGAR成为抗肿瘤治疗作用靶点的可能,为临床抗肿瘤治疗尤其是对表阿霉素耐受的肝癌治疗提供理论基础及依据。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of adriamycin on the expression of apoptosis in hepatocellular carcinoma cells ( HCC ) cells by means of Western blot and Western blot . The effects of adriamycin on the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells were detected by Western blot . In order to further study the mechanism of apoptosis of hepatocellular carcinoma cells induced by adriamycin , it is suggested that the increase of the level of apoptosis in liver cancer cells induced by ADM and the inhibition of apoptosis in hepatocellular carcinoma cells induced by adriamycin .
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

【共引文献】